在黑色素瘤中异常表达的MHCII类受体Word文档格式.docx

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总之，我们的结果表明了一种被MHCII类分子的异常表达激活的新免疫逃离机制的存在，这种机制靠吸引肿瘤特异性CD4+T细胞引发肿瘤坏死因子主导的局部炎症反应转而去抑制CD8+T细胞的反应。

CancerRes;

75（18）;

3747–59.2015AACR.

引言

在没有局部的炎症反应的情况下，MHCII型表达主要限于造血细胞和胸腺上皮。

然而，某些类型的实体瘤，包括黑色素瘤亚单位，能从头组成表达MHCII类分子。

另外，通过暴露于细胞因子例如IFNγ的方法，MHCII类可在几种细胞类型（包括肿瘤细胞）中被诱导表达。

在黑色素瘤的MHCII类表达先前已发现与较短和较长的存活都相关联。

的确，MHCII类表达可以使这些肿瘤被的肿瘤抗原特异性CD4+T细胞直接检测。

我们和其他人曾证明这种CD4+T细胞能够产生Th1应答响应于自体肿瘤抗原。

与此相反，最近的研究提出，分别表达在肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞的MHCII类分子与由淋巴细胞激活基因3（LAG3）的接合，可能会触发促存活信号和肿瘤细胞的抗细胞凋亡。

此外，LAG3已被表征为免疫抑制性受体，并且其在T细胞上的接合可以在启动阶段而不是在效应阶段介导肿瘤微环境中的免疫反应的下调。

为了阐明MHCII型表达与CD4+T细胞应答和CD4+T细胞的功能性模式在黑素瘤中的关联，我们进行了扩大的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的一种多功能分析直接识别了一组的38自体配对的晚期患者产生的黑色素瘤细胞系。

我们的研究结果揭示了一个新机制，MHCII表达的黑色素瘤对炎性CD4+T细胞存在吸引，并且通过IFNg-介导及TNF诱导免疫反应局部扩大来反作用CD8+T细胞应答，起到抑制作用。

材料和方法

病人和样品

科学伦理委员会批准了在丹麦的首都地的所有的程序。

根据赫尔辛基宣言在任何操作之前患者签署书面知情同意书。

所有患者都被诊断为组织学确诊的晚期黑色素瘤，AJCCⅣ期（N¼

32）或IIIB（N=1，完全切除），IIIC（N¼

5，其中两种是完全切除）。

从ESTDAB得到（http:

//www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）原发黑素瘤的WM-115，FM-55-P，FM-55-M1，和FM-55-M2的肿瘤细胞系。

WM-115，WM-75，WM-793，和WM-266-4已被描述过特征。

用于流式细胞术的抗体

用流式细胞仪抗体小组分别为：

-CD4+和CD8+T细胞应答的多方面特性：

CD4QDOT705（LifeTechnologies公司），CD8QDOT605（LifeTechnologies公司），近红外活/死可固定死细胞染色即（LifeTechnologies公司），MIP-1AFITC（eBioscience公司），MIP-1BPerCP-eFluor710（eBioscience公司），CD107aBrilliantViolet421，IFNGPE-Cy7，TNF-APC，IL2BrilliantViolet650（Biolegend公司），IL17ABrilliantViolet510。

-所有其他肿瘤的T细胞共培养实验：

CD4FITC，CD8PerCP，可固定活力染料eFluor450（eBioscience公司），IFNPECy7，TNF-APC，CD107aPE。

-MHCI类特性：

抗HLA-ABC的APC，7-AAD

-MHCII类特性：

抗HLA-DP，DR，DQFITC，7-AAD

TIL和黑色素瘤细胞系的制备

本研究使用的TIL是按照在其他研究中广泛描述的实验过程得到的。

简要地说，在无菌条件下将手术的切除黑色素瘤肿瘤切成1〜2立方毫米小碎块，将浸润淋巴细胞从这些肿瘤中分离开，并在高剂量的IL2（​​6000IU/mL的IL-2;

Proleukin诺华）保持最低限度地扩增。

当获得最少50X106肿瘤浸润淋巴细胞时（该产物在通常手术切除之后约14-28天此阶段被命名为“微创培养的TIL”），扩增是由标准的14天快速扩增实验（REP）进一步实现的，在其中的TIL在用200倍过量的同种异体的来自至少三个不同健康供体照射处理过的外周血单核细胞（PBMC）和30纳克/毫升抗CD3抗体（OKT3，Janssen-CilagorMiltenyiBiotec）非特异性地扩增。

在本篇文章中，该TIL被命名为“扩大的TIL（expandedTILs）”或“REP-TIL。

”从一些病人的肿瘤碎片提取“未培养（或鲜）肿瘤浸润淋巴细胞”。

肿瘤碎片用添加了1毫克/毫升胶原酶IV型（Sigma-Aldrich公司）和0.0125毫克/毫升dornase阿尔法（Pulmozyme，罗氏）的消化液消化过夜并立即冷冻保存。

在REP之前，根据制造商的说明利用阳性磁力选择（positivemagneticalselection）分别使用CD8或CD4的磁珠（美天旎）筛选TIL，得到纯CD8+或CD4+T细胞群。

并得到设计实验中所要使用的分好类的T细胞。

随后，分选亚群们分别进行扩增。

只有CD8+或CD4+T细胞的浓度达到95％以上的培养物被用于接下来的实验。

自体黑素瘤细胞系分别TIL从产生，无论是从肿瘤碎片或从运输培养基中悬浮回收细胞团或从组织碎片中，如先前文献所述（16，18）。

通过流式细胞仪分析T细胞应答

如先前文献所述（10，16），进行T细胞反应的测定。

简要地说，TIL解冻，并在RPMI-1640（LifeTechnologies公司）静置3天（用于REP的TIL的多官能表征），2天（最低限度培养的TIL），或过夜（在所有其它情况下）中补充有10％AB人血清（SigmaAldrich），之后洗涤两次，与自体短期培养的黑素瘤细胞系共培养。

肿瘤反应性通过评估先前门控为CD4或CD8T细胞表达的细胞因子（IFNG和TNF）或CD107a的表达量来评估。

为了筛选CD8+和CD4+T对自体肿瘤抗原的细胞反应，对数期生长的自体肿瘤在100IU/毫升IFNG（Imukin，勃林格殷格翰）孵育72小时，然后充分洗涤，并添加到共培养物中。

这样做是为了能最大限度地检测到低频的与MHC表达下调的自体肿瘤与或没有组成型MHCII类表达抗肿瘤反应。

反应被定义为在相对CD8+或CD4+T细胞亚群中，最少有0.5％的应答细胞的存在（表达出下列T细胞功能中的至少一种：

TNF，IFNG，或CD107a），最少50的阳性事件发生和与背景（即，未刺激的样品）相比至少三倍的T细胞的功能阳性细胞的频率。

肿瘤反应性细胞在刺激的样品中的频​​率中减去由未刺激样品的。

0.5％作为判定显著性的底限。

对于MHCII类阻断实验，肿瘤细胞37℃在20毫克/毫升抗HLADR，DP，DQ抗体（克隆TU39，从Biolegend公司）温育30分钟，或在相关同种型对照中温浴。

然后，肿瘤细胞加入和没有附加洗涤的TIL（最终浓度在T细胞刺中激鸡尾酒约为0.5毫克/毫升）到共培养物中。

进行聚合四聚体（肽-MHC多聚体的PE缀合并在内部产生HLA-A2限制性MART-1/Melan-A衍生肽ELAGIGILTV）和细胞内细胞因子染色（CD107a聚乙烯是在此情况下与CD107aFITC替换）染色，评估MART-1特异性T细胞产生功能的反应的频率，如先前文献所述（10）。

在多官能表征实验（7个T细胞功能表征），在共培养基中与自体肿瘤细胞的孵育时间被延长至12个小时，以便能够检测早期和晚期的细胞因子产生。

那里要指出的是用1000UI/毫升的TNF（CellGenix）或100IU/mL的IFNG或两者都处理72小时的癌症细胞。

由于由CD8+T细胞的多个T细胞功能的同时阳性评估的高灵敏度，要同时表达TNF，IFNG，和CD107a中的至少两个功能（双阳性细胞）被选为总CD8肿瘤反应性的量度，以评价肿瘤坏死因子（TNF）对CD8+T细胞识别的影响。

T细胞反应的多官能表征细胞使用BDFACSCantoII流式细胞仪或用5laserBDLSRII。

流式细胞仪配备了FACSDiva的软件6.3（BD）。

ELISPOT和细胞毒性试验

如先前文献所述（16）进行IFNγELISPOT实验。

共有3×

104的TIL（分别是3×

104CD8+T细胞，3×

104CD4+T细胞，或1.5×

104CD8+加1.5×

104CD4+T细胞，使得肿瘤浸润淋巴细胞的总量是在每一个孔相同）和3×

103癌细胞加入各孔。

一式三份孔进行了分析。

结果为在受刺激的孔中IFNγ斑点减去背景。

对CTL介导的细胞毒作用的常规的51Cr释放测定法进行如别处（19）中所述。

癌细胞的分析

MHC表达分析。

半定量测定癌细胞的MHCI类或II类表达，进行标准染色鉴定，新鲜分离的肿瘤细胞与抗HLA-ABC或HLA-DP，DR，DQ抗体或同种型对照，洗涤，在采样前5分钟加入2mL的7-AAD到每个样品中。

用BDFACSCantoII流式细胞仪收集细胞，并考虑到不同的自体荧光的个体细胞系的电压参数，对每个细胞系进行了调整以获得275±

15的APC平均荧光强度（MFI）和65±

5的FITCMFI。

鉴于几个肿瘤细胞株中的非均匀MHCII类染色，当所研究的抗体样品染色的MFI超过同种型对照至少四倍染色，黑素瘤被确定为MHCII型阳性。

细胞增殖分析如先前所述（10）使用流式细胞术为基础的计数法对细胞增殖进行了评价。

简要地说，在标准胰蛋白酶消化后，实验开始前一天（-1day），将黑色素瘤细胞接种在5至8×

104/孔的24孔板中，生长24小时后，加入标准培养基。

然后，培养基换成新鲜标准介质±

从对应的患者取得的活化的CD4+T细胞上清液的稀释液，从而使得0.5mL的终浓度/孔。

基线对照孔在0天用50毫升每孔胰蛋白酶溶液进行胰蛋白酶处理，同时使用含0.05毫克/毫升碘化丙啶（PI;

Sigma-Aldrich）250毫升标准培养基加入到每个孔中，以排除死细胞。

所得悬浮液在BD的FACSCantoII流式细胞仪配备有BDFACS装载机转盘，标准的速率下计数一定时间（90秒，高流动速率）。

在药物中暴露72小时后，将其他孔用胰蛋白酶处理和之后的基线对照孔在相同的工作条件的细胞进行计数。

用下列公式计算生长抑制：

（T72-T0）/（K72-T0）×

100，其中T72是72小时后的细胞数，T0是在零时间对照的细胞数，K72是对照孔（培养基）72小时后的细胞数。

对照值被任意设定为100。

低于0表示元细胞丢失