伦尔欣对糖尿病大鼠肾小球血管细胞外基质表达的干预作用Word文件下载.docx
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细胞外基质
InterventionofLunerxinontheexpressionofglomerulusextracellular matrixinstreptozotocininduceddiabeticnephropathyrats
ABSTRACT:
ObjectiveToobservetheregulatoryeffectofLunerxinonglomerulusextracellularmatrixofstreptozotocininduceddiabeticrats.MethodsDiabeticnephropathyinratswasinducedbyintraperitonealinjectionofstreptozotocin.Theratswereallocatedtonormalcontrolgroup,modelgroup,andLunerxingroupfor16weeks.Afterthetreatment,bloodadvancedglycosylationendproductlevel,malonaldehyde（MDA）,erythrocuprein（SOD）,urinaryalbuminexcretionrateofthe24hours,andclearancerateofcreatinine,aswellascollagenⅠandHSPGweredeterminedbyinsituimmunohistochemistryindifferentgroups.ResultsDiabetesmellitusandrenalfunctionlesionoccurredinthetwomodelgroups.Lunerxincouldimprovethegeneralstate,anddecreaseadvancedglycosylationendproducts,bloodureanitrogen,serumcreatinine,urinaryalbuminexcretionrateofthe24hoursandtheexpressionofcollagenⅠ.Itincreasedclearancerateofcreatinineandexpressionofheparansulfateproteoglycaninthekidneysignificantlyatthesametime.ConclusionLunerxinhascertainprotectiveeffectonthekidneybyregulatingtheexpressionofglomerulusextracellularmatrix.
KEYWORDS:
Lunerxin;
diabeticmodel;
extracellularmatrix
细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）散在分布于肾小球，是肾小球基底膜的重要组成成分。
Ⅰ型胶原（collagenⅠ,CⅠ）与糖尿病肾纤维化关系密切，硫酸乙酰肝素蛋白（heparansulfateproteoglycan,HSPG）已被证明对保持电荷屏障有重要作用，故两者成为实验研究的重点和热点。
目前，糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）的诊疗进展迅速，糖基化终产物（advancedglycationendproducts,AGEs）的形成和氧化应激在糖尿病肾病发病中的作用已逐渐被重视[12]，并且在动物实验应用盐酸氨胍特异抑制AGEs的形成，延缓糖尿病肾病的发生、发展起到一定的效果。
但是，由于其毒副作用大，未能进入临床。
有报道葛根素（puerarin）在抑制AGEs产生的同时还可减少AGEs的产生，故我们通过免疫组化染色观察伦尔欣（葛根素）对肾小球细胞外基质Ⅰ型胶原、HSPG表达的干预，从而探讨葛根素对糖尿病肾病的保护作用的机制。
1材料与方法
实验动物雄性SD大鼠40只，2月龄左右，体重200-250g，清洁级；
由湖南农业大学动物部提供。
实验期间自由饮水，摄食饲料为中南大学动物中心提供的混合饲料，适应性喂养1周后进行实验。
室温18-28℃，相对湿度62%-80%。
仪器和试剂美国强生手持式快速全血葡萄糖测试仪，FJ2008型免疫细胞记数仪，日丽7170型自动生化仪，链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,Sigma,Co.USA），伦尔欣注射液（湖南益侨制药有限公司生产，批号：
20060612）；
丙二醛（malonaldehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（erythrocuprein,SOD）试剂盒（南京建成生物公司）；
晚期糖基化终末产物（advancedglycosylationendproducts,AGEs）ELISA试剂盒购自美Genelab公司（LotNo17998），SP免疫组化染色试剂盒、兔抗鼠Ⅰ型胶原抗体、兔抗鼠硫酸乙酰肝素蛋白多糖抗体由北京莱博生物实验材料研究所提供。
方法与分组动物建模：
大鼠预养1周后，空腹12h，腹腔注射STZ柠檬酸钠缓冲液（STZ60mg/kg体重。
STZ在柠檬酸钠缓冲液中的质量分数为）。
对照组注射等量柠檬酸钠缓冲液，依据72h后尿糖～，静脉采血测血糖（怡成全血葡萄糖测试仪），血糖≥/L者，确定模型建立。
除去造模失败及死亡大鼠，将20只糖尿病鼠纳入本实验。
分组：
①正常对照组（CN组10只）；
糖尿病鼠随机分为②糖尿病组（D组10只）和③伦尔欣治疗组（D+P组10只）。
伦尔欣治疗组每只腹腔注射伦尔欣80mg/（kg·
d），均连续给药16周。
各组为了避免酮症和维持糖尿病鼠的生存，D组、D+P组隔日腹腔注射长效胰岛素2-4u，并断尾取血测大鼠血糖，使血糖波动在25mmol/L左右，实验共16周。
标本采集第16周实验终止时，各组大鼠在禁食的基础上，用代谢笼收集24h尿，测定尿白蛋白（UAE）含量，动物经乙醚麻醉后股动脉放血5mL测大鼠糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧化酶、血肌酐，计算内生肌酐清除率。
取左侧肾脏反复灌洗至发白，剔除包膜，横断切取约柱状体2块，置于（多聚甲醛在磷酸盐缓冲液中的质量分数为）多聚甲醛（含1∶1000焦碳酸二乙酯）中固定12h，石蜡包埋，连续切片。
观察指标①生化指标：
用全自动生化仪测血肌酐：
AGEs应用竞争性ELISA法；
MDA采用硫代巴比妥酸法；
SOD采用黄嘌呤氧化物酶法；
②尿白蛋白排泄率（urinaryalbuminexcretion,UAE）：
收集24h尿液，用二甲苯防腐，混匀后取2mL用免疫细胞记数仪测定；
③肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate,GFR）：
以内生肌酐清除率为代表，GFR＝（尿肌酐×
尿量）÷
血肌酐。
免疫组化检测的操作步骤见北京莱博生物实验材料研究所实验指南。
免疫组化结果的图像分析采用计算机显微图像处理系统，在400放大倍数下每张片子随机选取10个视野区，对杂交信号结果进行灰度扫描，以其平均相对灰度值作为表达量的值（用均数±
标准差表示）。
免疫组化结果的定性判别方法在显微镜下根据着色程度按以下标准判定结果：
①阴性（-）：
无黄色；
②弱阳性（+）：
淡黄色；
③阳性（）：
黄色；
④强阳性（）：
深黄色或黄褐色。
统计学处理测定数值皆以±
s表示，利用软件进行组间方差分析，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析和q检验。
2结果
药物对大鼠糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧化酶、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率的影响结果显示：
造模成功的大鼠血清糖基化终末产物、丙二醛、尿白蛋白排泄率较正常组明显升高，超氧化物歧化酶、内生肌酐清除率下降，差异显着（），D组和伦尔欣治疗组比较，糖基化终末产物、丙二醛、尿白蛋白排泄率明显升高，超氧化物歧化酶、内生肌酐清除率下降（，表1）。
药物对大鼠肾小球CI、HSPG表达的影响HE染色结果显示：
光镜检查各组大鼠肾小球及小管间质未见明显的病理改变；
模型组大鼠肾组织可见肾小球明显增大，肾小球细胞增生，散在肾小管上皮细胞肿胀变性、脱落，肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚。
用药组中上述病理改变均有不同程度的减轻。
免疫组化结果显示：
与糖尿病相比，正常组状态下肾小球着色浓集，在肾小球系膜细胞、血管内皮细胞及少量肾小管上皮细胞胞外均可见棕黄色颗粒颜色加深且数量增多，肾小球血管细胞外基质HSPG表达显着上调，呈强阳性，CI表达呈阴性，经灰度值测定两组间差异有显着性差异（）；
治疗后，伦尔欣治疗组肾组织着色较浓集，与D组相比CI表达呈弱阳性（），HSPG相对表达含量明显上调，呈阳性（，图1-2、表2）。
表1各组大鼠糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧化酶、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率的变化的比较
Table1ChangesofSerumadvancedglycosylationendproducts,malonaldehyde,erythrocuprein,urinealbumin,andclearancerateofcreatinineindifferentgroups
*vs.CNgroup;
△vs.Dgroup.AGEs:
advancedglycosylationendproducts
图1CollagenⅠ免疫组化的图片
ImmunohistochemicalanalysisforCIexpressioninglomeruliofrats（×
400）
A:
controlgroup;
B:
Dgroup;
C:
D+Pgroup
图2HSPG免疫组化的图片
ImmunohistochemicalanalysisforCIandHSPGexpressioninglomeruliofrats（×
表2免疫组化各组大鼠肾小球CI、HSPG表达的灰度值的比较
Table2ChangesofimmunohistochemicalopticaldensityCIandHSPGindifferentgroups
△vs.Dgroup.CI:
collagen
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