微生物遗传实验文档格式.docx

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魔芋粉5g，NH4Cl5g，MgSO4·

7H2O1g，KH2PO41g，Na2HPO4

0.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。

（每组配20ml）

（2）分离培养基：

魔芋粉5g，MgSO4·

7H2O5g，KCl5g，NaNO33g，K2HPO4

1g，FeSO4·

7H2O0.01g（由实验员提前配成10%的母液，然后加0.04ml），琼脂18g，蒸馏水1000mL，加入0.4ml5%曲里苯兰，自然pH。

（每组配400ml，分2瓶子装，倒12块平板）

（3）种子培养基：

魔芋粉10g，蛋白胨3g，酵母粉5g，MgSO4·

7H2O5g，KCl

5g，NaNO33g，K2HPO41g，FeSO4·

7H2O0.01g（由实验员提前配成10%的母液，然后加0.1ml），蒸馏水1000mL，自然pH。

（每组配100ml，分三个装）

（4）无菌水：

1个50ml的；

7个装有0.9ml水的EP管。

（每组）

（5）灭菌枪头，灭菌牙签（装在培养皿中灭菌）（分组准备）

五、实验步骤：

1．β-甘露聚糖酶产生菌的富集培养

第一天的实验：

土样中菌株的富集：

称取5g土壤（每组从不同地方采样，有的从附近菜园及菜园的不同地点，有的从树木底下，有从魔芋种植基地采样）于含有50mL无菌水的三角瓶中，37℃，170rpm摇床培养1h，取1mL土壤悬液接种到20mL富集培养基中，37℃，170rpm培养24h。

选择培养基粘度明显下降的富集液（这时，全班比较，看哪个地方的土壤富含这种微生物）。

2.β-甘露聚糖酶产生菌的筛选

第二天实验：

将富集液用无菌水稀释到10-7稀释度，分别取10-7，10-6，10-5,10-3稀释液（注：

吸取0.1ml富集液加入到0.9ml无菌水，此为10-1，然后吸取0.1ml10-1加入到0.9ml无菌水，此为10-2，以此类推）各100μL涂布到分离培养基上（注：

需要四块分离培养基，提前准备好）；

倒置于37℃培养箱中培养24h后，观察是否产生透明圈，作为菌株产β-甘露聚糖酶能力的初步检测，筛选透明圈大、透明度好的菌株。

第三天实验：

挑取平板上产生透明圈的单菌落（注：

因实验室条件有限，最多挑5个菌落），在分离培养基上经多次划线纯化后,37℃倒置培养24h（注：

需要5块分离培养基，提前准备好）。

第四天实验：

将分离的单菌株点种（用灭菌牙签或灭菌枪头）在分离培养基平板上点一下，但不要戳破培养基。

（注：

需要1块分离培养基，提前准备好），37℃倒置培养24h后，选择透明圈大（透明圈直径/菌落直径比值）且透明度好的菌株接入到种子培养基进行摇瓶复筛。

（只需要挑出透明圈最大的的几个）。

3.将初筛得到的菌株接入种子培养基中。

第五天实验：

将37℃，170rpm培养14h。

然后将种子培养液按2％的接种量转接到发酵培养基中，37℃，170rpm摇瓶培养24h收集发酵液。

测定发酵液中酶活力的大小，筛选出酶活力高的菌株。

4．粗酶液的制备（注：

因条件有限，4-5步实验不做，但学生需要了解实验的过程和步骤）

将发酵液分装到离心管中，4℃、10000rpm离心5min，上清液即为粗酶液。

5.β-甘露聚糖酶活力的测定

本实验是利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后，还原糖被氧化成糖

酸，3,5-二硝基水杨酸被还原成棕红色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水杨酸），在

一定范围内棕红色物质颜色的深浅与还原糖的量成一定比例关系，可以用于比色

测定。

此方法操作简便、快捷，且受杂质干扰较少。

（1）标准曲线的绘制

分别取甘露糖标准液（1mg/mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，

1.8mL置于25mL具塞试管中，以蒸馏水补足2.0mL，加入2.0mLDNS试剂。

置

沸水浴中煮沸5min，显色，用流水迅速冷却后，用蒸馏水定容至25mL，以空白

液调零，在波长540nm处测定吸光值，以甘露糖浓度（g/L）为横坐标X，吸光值

（A540）为纵坐标Y，绘制标准曲线。

（2）酶活力的测定

以0.5％（w/v）的葡甘聚糖做底物（用0.05mol/L，pH7.0的磷酸钠缓冲液配制），

参照Akino等[l]的DNS法，在0.9mL底物中加入0.1mL适当稀释的酶液，在55℃下水

浴反应10min，加入2.0mLDNS试剂，在沸水中煮沸5min，流水迅速冷却后加蒸馏

水定容至25mL，以空白液调零，在波长540nm处测吸光度。

每次做有底物无酶的

空白试验。

酶活力单位定义为：

在上述反应条件下，以0.5％葡甘聚糖为底物，每分钟释

放1μmol相当于D-甘露糖的还原糖所需的酶量为一个酶活单位（U）。

六、实验报告和作业

1.采样时有什么要求？

2、可不可以直接以平板上透明圈的大小判定菌株产酶活力的高低？

实验三、β-甘露聚糖酶产生菌的鉴定

菌种鉴定的主要目的是为了了解筛选到的菌种的属性，并在此基础上改良菌

种使其符合工业化生产的要求。

优良的菌种不仅是提高酶制剂产量的关键，而且

还与缩短发酵周期、改良发酵工艺等密切相关。

酶制剂的质量和产量主要是由菌

种的性质所决定的，所以筛选优良的菌株在酶的获得中尤为重要。

微生物菌株的鉴定方法主要有：

形态特征、培养特征鉴定、生理生化特性鉴

定和16SrDNA的分子鉴定。

微生物形态与培养特征的鉴定主要是指微生物在培养

基中的菌落形态以及个体形态特征。

生理生化特性的鉴定主要是根据各种微生物

的新陈代谢类型不同，进而测定微生物利用各种物质后所产生的产物，如吲哚试

验、甲基化试验、淀粉水解试验、硫化氢试验等。

四、培养基及需提前准备的材料

（一）培养特征鉴定培养基

（1）分离培养基：

7H2O5g，KCl5g，NaNO33g，K2HPO4

7H2O0.01g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。

（一）常规实验试剂

（1）草酸铵结晶紫染液

溶液A：

结晶紫2g，95％乙醇20mL；

溶液B：

草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。

将A、B二液混合均匀，静置48h后使用。

（2）卢戈氏（Lugol）碘液

碘片lg，碘化钾2g，蒸馏水300mL。

（3）番红复染液

番红（safranineO）2.5g，95％乙醇100mL，混匀后取10mL，加入80mL蒸

馏水混匀即成。

（4）孔雀绿染色液

孔雀绿（malachitegreen）5g，蒸馏水100mL。

（5）番红水溶液（芽孢染色液）

番红（safranineO）0.5g，蒸馏水100mL。

3.1.5实验方法

3.1.5.1β-甘露聚糖酶的产生菌的常规鉴定

（1）培养特征和形态特征的鉴定

将复筛得到的菌株在分离培养基上37℃倒置培养48h后，参照沈萍的方法

观察菌落的形状、大小、光泽、颜色、粘度、透明度、边缘等外观特征，测量菌

株大小，并进行革兰氏染色、芽孢染色。

（2）生理生化特征实验（注：

因条件有限，生理生化实验不做，但学生需要了解实验的过程和步骤））

１、糖酵解试验

　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。

可用指示剂及发酵管检验。

　　试验方法：

以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。

接种后，置36±

1.0°

C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。

　　本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。

一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。

２、淀粉水解试验

　　某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。

淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±

1°

C培养24~48h，或于20°

培养5天。

然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。

立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。

阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

　　淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。

培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。

淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

３、V-P试验

　　某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

　　１）O’Meara氏法：

将试验菌接种于通用培养基，于36±

C培养48h，培养液1ml加O’Meara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±

C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。

亦有主张在48~50°

C水浴放置2h后判定结果者。

　　２）Barritt氏法：

C培养4天、培养液2.5ml先加入5°

Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±

C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

　　３）快速法：

将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。

不产酸的培养物不能使用。

　　本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。

在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。

４、甲基红（MethylRed）试验

　　肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

挑取新的