微生物限度检查操作规程中国药典15版四部通则.docx

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微生物限度检查操作规程中国药典15版四部通则

标题

微生物限度检查操作规程

编码：

07-13-2

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起草人

审核人

批准人

起草日期

审核日期

批准日期

起草部门

质量管理部

颁发部门

办公室

生效日期

一、范围：

本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。

二、引用标准：

《中国药典》2015年版（通则1105-1106）

三、目录1．微生物限度标准

2．设备、仪器及用具

3．消毒液、稀释剂、试液及培养基

4．检查总则（通则1105：

非无菌产品微生物限度检查：

微生物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：

控制菌检查法）

5．微生物计数法检查

6．控制菌检查法

7．实验技术

8.附件

1．微生物限度标准

非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准

需氧菌总数（或）

霉菌和酵母菌总数（或）

控制菌

药用原料及辅料

103

102

*

*未做统一规定。

1.1成品微生物限度标准

品名

法定标准

内控标准

需氧菌总数（或）

霉菌和酵母菌总数（或）

控制菌

需氧菌总数（或）

霉菌和酵母菌总数（或）

控制菌

大肠埃希菌

沙门菌

大肠埃希菌

沙门菌

乳糖

≤1000

≤100

—

无

≤100

≤50

—

—

无水乳糖

≤100

≤10

—/10g

—/100g

≤100

≤10

—/10g

—/100g

蔗糖

无

无

无

无

≤100

≤50

—

—

（1）．“—”为不得检出。

（2）．目测霉变者以不合格论。

（3）．“无”为标准依据或无相应规定。

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1.2工艺用水微生物限度标准

品名

法定标准

内控标准

需氧菌总数（）

控制菌（100或100）

需氧菌总数（）

控制菌（100或100）

生活饮用水

≤100

不得检出

≤100

不得检出

纯化水

≤

不得检出

≤80

不得检出

1.3内包装材料微生物限度标准

品名

（单位）

需氧菌总数

霉菌和酵母菌总数

控制菌

需氧菌总数

霉菌和酵母菌总数

控制菌

药用聚乙烯烃塑料袋（1002）

≤1000

≤100

—

≤100

≤10

—

说明：

1．“—”为每1002中不得检出。

2．目测霉变者以不合格论。

3．“无”为标准依据或无相应规定。

2．设施、仪器及用具

2.1、设施：

2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：

微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

2.1.2．其他设备：

高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。

生化试剂储存箱。

2.2仪器及器皿

2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；系列比色计。

2.2.2．玻璃器皿：

锥形瓶（250~300，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12）、培养皿（∮9）、量筒（100）、试管（18×180）及塞、吸管（1分度0.01，10分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：

先用流水冲洗，浸泡于12%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。

用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。

2.3用过的玻璃器皿：

2.3.1未被病原微生物污染的器皿：

可随时洗涤。

用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。

容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次。

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2.3.2已被病原微生物污染的器皿：

需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。

试管及培养皿：

先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30分钟。

趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。

吸管：

全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。

24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。

载、盖玻片：

应分别浸泡于清洁液12~24小时后，取出用流水冲洗，再放入35%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10~15分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。

沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。

2，3，3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。

吸管口上端距0.5处塞入约2的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。

锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。

玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干备用。

2.4用具

2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用7075%乙醇溶液浸泡）。

2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。

也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。

2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4~5、长度6~10）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12）、实验记录纸等。

3消毒液、稀释剂、试液及培养基

3.1消毒液、稀释剂及试液。

3.1.10.1%苯扎溴铵溶液：

供洗手、擦拭操作台面用。

3.1.25%石碳酸溶液：

配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其他适宜消毒液。

3.1.3．75%乙醇溶液：

配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。

3.1.4．0.9%无菌氯化钠溶液：

取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000，121℃灭菌20分钟。

3.1.5．司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80：

供非水溶性供试品供试液制备用。

3.1.6．无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（）：

取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10。

3.1.7．甲基红指示液：

取甲基红0.1g，加入95%乙醇300，水适量，使溶解，再加水至500。

3.1.8．试液：

①氢氧化钾试液：

取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100；②α-萘酚乙醇试液：

取α-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100。

3.1.9．革兰染色液：

①沙黄染液：

取沙黄0.25g，加95%的乙醇10，使完全溶解后，加水至100；②结晶紫染液：

取结晶紫1.0g，加95%的乙醇20，使溶解，加1%的草酸铵溶液80，混匀。

静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存；③碘试液：

取碘化钾2.0g，加水3~5使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300，置密

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闭棕色瓶中储存。

3.1.10．中性红指示液：

取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60，使溶解，再加水到100。

变色范围6.8~8.0（红→黄）。

3.1.11．亚甲蓝指示液：

取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100。

3.1.12．溴麝香草酚蓝指示液：

取溴麝香草酚蓝0.4g，加1氢氧化钠溶液0.64使溶解，再加水至100。

变色范围6.0~7.6（黄→蓝）。

3.1.13．酸性品红指示液：

以酸性品红0.5g，加水100使溶解，再逐渐加1氢氧化钠溶液16，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。

优点：

无色，在倒管内早期发酵易观察，不易被还原。

变色范围6.0~7.4（红→黄）。

3.1.14．曙红钠指示液：

取曙红钠2.0g，加水使溶解成100。

3.1.15．靛基质试液：

取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置

冰箱保存，备用。

3.2培养基

3.2.1．培养基的制备及储存

3,2,1,1溶化：

一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。

加入纯化水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。

3.2.1.2在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10~15分钟，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要加热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。

3.2.1.3校正酸碱度：

培养基必须有适当的值。

测定值是培养基配制过程中的重要步骤之一，干燥培养基一般已校正过值，用时也必须再验证。

值测定时，一般用指示剂滴入培养基中观察其颜色的变化，或用计校正，如与所需值不符，可用酸或碱液加以校正。

一般用氢氧化钠校正的弱碱性培养基，高压灭菌前培养基的值高0.2左右，灭菌后基本合适。

调整值后要加热过滤，使培养基澄清。

3.2.2培养基的分装：

3.2.2.1液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加入成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。

3.2.2.2固体培养基一般分装在250、500锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。

平皿：

如倾注平皿，应在无菌室中放置3～4小时，如用塑料平皿须在35℃培养箱中倒置30～60分钟。

水蒸气会自然蒸发。

斜面：

制备低层斜面分装于试管，约占容积的1/5，灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装时注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，避免污染。

制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。

3.2.3培养基的灭菌：

培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。

普通培养基多采用121℃、103.42灭菌15分钟，但容器和装量较大时，可延长至20分钟。

高压灭菌应严格按照操作规程进行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的冷空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全杀灭微生物的目的。

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3.2.4培养基的储存：

保存培养基的时间需视培养基中水分蒸发的程度及有无污染而定，已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中，但由于各种培养基的性质不同，不可能

固定一个保存期限。

制备好的平板或试管培养基，为防止水分蒸发，应置于塑料袋内，4℃保存，可延长使用期限。

微量生化反应管熔封于细玻管内，室温下可保存1年左右。

3.3注意事项：

3.3.1采用干燥培养基时，按说明配制，应对灭菌后的培养基值进行校验。

若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂的用量。

试剂规格要求应为化学纯（）以上规格，其中不能含有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害的抑制物。

3.3.2配制的培养基不应该有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，并应于2小时内灭菌，避免细菌繁殖。

3.3.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。

包装时，塞子必须塞

紧，以免松动或脱落造成染菌。

3.3.4配制培养基的值测定时，其波动范围应在规定的±0.2之内，还需注意高压灭菌后的值变化。

3.3.5