川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经细胞凋亡的阻碍Word格式.docx

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【关键词】川芎嗪癫痫放电神经元青霉素NF-κBp65

　　癫痫是以大脑神经细胞群反复超同步放电引发的发作性、突然性、短暂性脑功能紊乱为特点,以反复痫样发作为表现的临床征候群,其发病机制尚未完全说明。

癫痫致脑损伤已被许多动物实验和临床观看所证明,神经细胞凋亡是最近发觉的癫痫脑损伤又一途径,虽显现较晚,但却能持续存在。

川芎嗪,化学结构为四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine,TMP）。

TMP可抑制海马神经元的放电活动,TMP可明显抑制吗啡依托大鼠戒断病症及体重下降［1］,大剂量TMP对缺血、缺氧性脑损伤、海马CA1神经元的缺血性损伤有改善或爱惜作用［2，3］。

TMP已被普遍应用于心、脑血管闭塞性疾病［4］的医治。

　　NF-κB普遍存在于真核生物中,是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。

它作为信号传导途径中的枢纽,与免疫、肿瘤的发生进展、细胞凋亡的调剂和胚胎发育等重要事件有着紧密联系,是一种重要的核转录因子。

目前,对NF-κB的研究已成为一个超级引人关注的领域［5］。

　　本课题采纳免疫组织化学方式、图像分析技术检测了TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内NF-κBp65蛋白的表达及平均光密度及阳性面积率的转变阻碍,进一步探讨TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元作用的机制。

　　1材料与方式

　　材料

　　实验动物SD大鼠（由武汉大学医学院实验动物中心提供）,雌雄不拘,体重200～250g。

　　实验药品及试剂盐酸川芎嗪注射液（批号0107001）,常州制药厂生产；

注射用青霉素钠（批号00109306）,华北制药股分生产。

　　实验仪器BL-410生物性能实验系统,成都泰盟电子生产；

江湾I-C型立体定向器,第二军医大学器材处生产。

　　方式

　　癫痫动物模型实验选用健康SD大鼠,用10%乌拉坦以10ml·

kg-1体重腹腔注射（ip）麻醉,将动物固定在江湾I-2C型立体定向器上,于大脑左、右双侧前卤后3mm,矢状缝旁开3mm行开颅手术,暴露大脑皮层记录区域（2mm×

2mm）,将银球电极置于左、右双侧的记录部位,信号输入置BL-410生物性能实验系统,进行左、右双侧脑电记录。

用浸有青霉素溶液的明胶海绵（200u/mm3）置于左侧大脑皮层表面,诱发大鼠大脑皮层癫痫样放电,待癫痫放电稳固后,移去明胶海绵,用浸有温热生理盐水棉球盖住创口。

　　实验分组及取材将实验大鼠随机分为3组,每组10只:

①A组（对照组）,麻醉开颅手术1h后取大脑;

②B组（模型组）,青霉素诱发癫痫1h后取大脑；

③C组（TMP组）,青霉素诱发癫痫放电稳固后,再腹腔注射TMP（20mg·

kg-1）,待抑制作用最明显时取大脑。

　　HE染色常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（厚约4μm）及HE染色。

　　免疫组织化学S-P法检测NF-κBp65蛋白相关抗原

　　要紧步骤：

　　①组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；

　　②3%过氧化氢，37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×

5min；

　　③Bcl-2采纳微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×

　　④正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反映；

　　⑤一抗37℃孵育1h，PBS洗4×

　　⑥生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×

　　⑦链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×

　　⑧DAB显色液显色，自来水冲洗终止反映；

　　⑨苏木精复染，脱水，透明，封片。

　　用PBS代替一抗作为阴性对照组，人扁桃体作为NF-κBp65的阳性对照组。

　　免疫组织化学结果判定

　　NF-κBp65相关抗原以胞膜或胞浆显现棕黄色颗粒为阳性反映。

阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反映物。

　　采纳HPIAS-2000高清楚度彩色病理图文报告治理系统（同济千屏影像公司）对NF-κBp65蛋白的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×

400），测定每一个视野下阳性反映的平均光密度、阳性反映面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。

以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反映的总面积/单位面积中细胞的总面积×

100％）。

　　统计学处置

　　对各组免疫组织化学反映阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q查验，查验水准α为。

　　2结果

　　NF-κBp65蛋白的表达：

A组（对照组）大脑皮层神经元胞浆内可见少量棕黄色颗粒，NF-κBp65表达弱；

B组（模型组）大脑皮层神经元胞浆内可见较多的棕黄色颗粒沉积，NF-κBp65表达强；

C组（TMP组）大脑皮层神经元胞浆内可见少量棕黄色颗粒，NF-κBp65表达弱。

图像分析结果显示：

A组（对照组）NF-κBp65蛋白表达的平均光密度为±

；

B组（模型组）NF-κBp65蛋白表达的平均光密度为±

C组（TMP组）NF-κBp65蛋白表达的平均光密度为±

A组（对照组）NF-κBp65蛋白表达的阳性面积率为±

，B组（模型组）NF-κBp65蛋白表达的阳性面积率±

，C组（TMP组）NF-κBp65蛋白表达的阳性面积率为±

经单因素方差分析，组间有显著性不同（P＜。

经q查验，B组（模型组）与A组（对照组）、C组（TMP组）之间NF-κBp65蛋白的平均光密度及阳性面积率有显著性不同（P＜，A组（对照组）与C组（TMP组）之间NF-κBp65蛋白平均光密度及阳性面积率的不同无显著性（P＞），见表1。

　　表1各组NF-κBp65蛋白表达的平均光密度和阳性面积率（略）

　　注：

*A组与B组比较，（P＜；

**B组与C组比较（P＜；

#C组与A组比较（P＞）。

　　3讨论

　　青霉素致大鼠癫痫模型是一种极为有效的、操作简便的实验动物癫痫模型,其癫痫放电持久稳固,能够用作抗癫痫药物疗效及癫痫发病机制的研究。

青霉素诱发的癫痫电活动是阻断了GABAa受体致使抑制神经网络功能失调而产生癫痫状态的。

细胞凋亡（apoptosis）［6］是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳固由基因调控的细胞主动死亡进程。

它是细胞在必然条件下，通过启动其自身内部机制，引发内源性DNA内切酶的激活而发生细胞的自然死亡。

细胞凋亡的进程不致使溶酶体及胞膜的破裂，没有细胞内涵物外泄，因此不引发炎症反映。

　　细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而致使的细胞死亡进程［7］。

不仅为维持正常生理功能所必需,而且与某些疾病的发生紧密相关。

有研究以为［8］,癫痫引发脑神经元丢失以细胞凋亡为主。

其发生的可能机制是:

凋亡刺激通过不同的受体包括NMDA、p75NTR等传入细胞内,引发凋亡相关基因如p53等的激活,促发细胞内一系列生化改变,如通过NMDA受体引发钙离子超载,激活Ca2+-Mg2+依托的核酸内切酶致使DNA断裂;

p75NTR介导信号那么可能与JNK激活有关,引发c-jun结尾磷酸化。

在中枢神经系统中［9］,NF-κB作为一种重要的"

应激传感器"

可通过其活化形式进入细胞核结合于DNA上相应位点,上调c-fos、c-jun、p53等靶基因的转录,神经细胞进入激活状态。

海马神经细胞活化即NF-κB/P65的核转位是PTZ点燃大鼠癫痫形成的重要机制之一［10］。

且癫痫发作时,NF-κB激活可增进iNOS等表达产生大量活性氧和自由基,氧化应激及各类炎症介质又可再次活化NF-κB、活化蛋白-1（AP-1）等,加速凋亡相关基因的表达,诱发神经细胞凋亡。

但也有研究说明［11］,NF-κB活化可介导细胞爱惜反映,诱导抗凋亡蛋白表达。

　　目前,已知川芎嗪有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抗脂质氧化、增加NO等作用［12］,其对中枢神经系统损伤的作用已有报告。

癫痫作为一种常见的慢性临床综合征,其发病机制一直是研究的核心,神经递质在其中起着不可轻忽的作用。

C2氨基丁酸（GABA）作为一种重要的抑制性神经介质,可避免神经元过度的同步和持续的放电,而癫痫样放电正是与一组神经元同时或快速反复放电的突然发生有关。

有研究结果说明,青霉素的致痫机理是其能阻断GABA受体,刺激谷氨酸释放,破坏细胞兴奋性和抑制性的平均,使兴奋性相对增高。

本实验结果显示,腹腔注射TMP（20mg·

kg-1）能使青霉素致痫后大脑皮层神经元内NF-κBp65蛋白降低,证明TMP能减少青霉素致痫后大脑皮层神经元的凋亡，使大脑皮层神经元维持正常结构。

神经元结构正常,脑内许多神经递质的合成才得以维持正常平稳状态,神经元的兴奋性才能维持稳固状态。

由此能够推测TMP抑制癫痫放电的作用机制可能是通过改善神经元的结构这一途径实现的。

现已公认GABA作为脑内要紧的抑制性递质,具有抗癫痫的作用,因此TMP可能是通过使神经元结构恢复正常而要紧阻碍GABA这种递质的合成而起到抗痫作用的。

TMP的有效成份能充分作用于脑组织,可能是通过其有效的抗氧化损伤和免疫调剂功能间接阻碍了IGF-一、NF-κB的表达［13～15］,从而有效抑制炎症反映,稳固细胞膜,减轻细胞内钙超载,抑制细胞凋亡,增进神经细胞的存活。

通过实验说明,TMP可明显使致痫大鼠脑组织NF-κB的表达降低,抑制神经细胞凋亡,增进细胞的存活,对神经细胞具有爱惜作用。

但也有报告NF-κB增进细胞凋亡,细胞凋亡与NF-κB的关系仍需进一步研究。

其确切机制还待进一步研究探讨。

【参考文献】

　　1汪运金,申国明,王饮茂.川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的爱惜作用.安徽中医学院学报,2000,19

（1）:

441～443.

　　2FengWuwei,ZhouXiaochen,Baihaibo,etal.HippocampalsliceAmodelinvitroforscreeningantiepilepticdrugs.ChinJApplPhysiol,2001,17（3）:

302～304.

　　3NIJW,MatsumotoK,WatanabeH.Tetramthylpyrazineimprovesspatialcognitiveimpairmentinducedbypermanentocclusionofbilateralcommoncarotidarteriesorscopolamineinrats.JpnJPharmacol