食品微生物检验学实验指导 0308文档格式.docx
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4）查MPN检索表，报告结果。
实验3大肠杆菌检验
1）样品前处理；
2）增菌（肠道增菌液）；
3）分离（麦康凯或伊红美蓝琼脂）；
4）革兰氏染色、镜检；
5）生化试验（TSI，pH7.2尿素，甲基红试验和吲哚试验，V-P试验和枸橼酸盐试验）
实验4金黄色葡萄球菌检验
1）将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂，接种生化培养基，进行纸片法药敏试验，培养；
2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；
3）观察主要生化试验结果和药敏试验结果。
4）报告。
实验5魏氏梭菌检验
1）细菌筛选（亚硫酸盐－多粘菌素－磺胺嘧啶，SPS琼脂）；
2细菌培养（液体硫乙醇酸盐培养基，FT培养基）；
3）动力硝酸盐还原实验；
4）暴烈发酵实验；
5）卵黄脂酶水解实验。
实验6罐头食品检验
1）罐头感观检查；
2）pH值测定；
3）染色镜检；
4）接种培养（庖肉培养，溴甲酚紫葡萄糖肉糖，麦芽浸膏汤）5）平板筛选（锰盐营养琼脂平板，血琼脂平板，卵黄琼脂平板）
实验7PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌
1）以鼠伤寒沙门氏菌以SdiA为模板设计引物：
（PCR产物长度：
562bp
FsdiA:
5′-tggcagcagaggatgtttat-3′
RsdiA5′-tcgatctccgatgaggtctt-3′
2）细菌单克隆水悬浮后做模板，做PCR
3）电泳检测是否扩出条带。
实验8霉菌检验
1）样品稀释2）平板接种培养（马铃薯－葡萄糖琼脂，孟加拉红琼脂）；
3）菌落计数
实习周:
鸡蛋中沙门氏菌筛选、分离、生化鉴定及嗜菌体检测
（一）样品前处理及增菌培养；
（二）沙门氏菌在选择平板上菌落特征观察；
（三）沙门氏菌染色特性和生化特性观察；
（四）沙门氏菌噬菌体鉴定。
实验一菌落总数测定
[目的与要求]
1.通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法，菌落计数和报告方式，以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。
2.菌落总数是指食品检样经过适当处理，在一定的条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其也是判定食品被污染程度的标志。
[实验器材及试剂]
温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、稀释液、营养琼脂、牛奶等。
[实验内容]
（一）检样稀释及培养：
1.以无菌操作，将检样（牛奶）0.5ml放于含有4.5mL灭菌生理盐水试管内，经充分振摇或研磨作成1：
10的均匀稀释液。
2.用无菌移液器吸取1：
10稀释液0.5ml，注入含有4.5mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1：
100倍稀释。
3.更换枪头后，再用无菌移液器，按
（2）操作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次换一只1mL无菌枪头。
4.根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，用移液器吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。
5.稀释液移入平皿后，应立即将冷至46℃左右营养琼脂培养基（可放置46℃水浴中保温）注入平皿约15-20ml，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lml灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对照。
6.待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养48±
2h。
（二）菌落计数
1选取30-300CFU之间，无蔓延生长的、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
（三）结果与报告
1菌落总数的计算方法
1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式
（1）计算：
N=∑C/（n1+0.1n2）d
（1）
式中：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
示例：
稀释度
1:
100（第一稀释度）
1000（第二稀释度
菌落数（CFU）
232，244
33，35
N=∑C/（n1+0.1n2）d
=（232+244+33+35）/[2+（0.1×
2）]×
10-2
=544/0.022
=24727
上述数据按2.2数字修约后，表示为25000或2.5×
104。
1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
2菌落总数的报告
2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；
也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
[思考题]
1菌落总数的食品卫生学意义？
2影响本实验结果的因素有哪些？
实验二大肠菌群数的测定
1．掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法，及实验结果报告方式。
2．了解大肠菌群的食品卫生学意义
[原理]
大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the
most
probable
number-简称MPN）表示。
样品：
牛乳
温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水等。
[实验内容]
一、常规检验法
1检样稀释及培养
取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成10倍递减的均匀系列稀释液，从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
2初发酵实验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±
1℃培养24h±
2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±
2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±
2h，产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
3复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±
1℃培养48h±
2h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
4大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
[思考题]
1为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？
2
复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？
表3-2 大肠菌群最可能数（MPN）检索表
阳 性 管 数
MPN
100ml（g）
95％可信限
1ml（g）×
3
0.1ml（g）×
0.01ml（g）×
下限
上限
1
2
＜30
30
60
90
＜5
90
120
＜5
130
160
200
190
10
210
40
70
110
150
230
1
360
200
240
290
140
260
370
270
340
440
280
350
420
390
470
530
100
1500
640
950
1200
1300
1800
430
750
1600
300
2100
2300
3800
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