免疫组化总结Word下载.docx

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|使用超纯水配制0.5%Tritonx-100,在100ml

超纯水中加入0.5mlTritonx-100后轻轻搅拌，尽量不要产生气泡，直至溶解完全方可使用。

4封闭血清：

根据二抗来源选择封闭血清，一般血清来源于二抗来源形同。

血清浓度为10%,TBS配制，或者使用3%

BSA配制10%封闭血清。

5抗体稀释液：

使用TBS配制3%BSA。

63%H2O2:

30%H2O2，超纯水配制。

7DAB显色液（试剂盒）配制:

1mlTBS中加50mlA液,50mlB液，充分混匀。

8荧光二抗的配制：

AlexaFlour488、594规格为2mg/ml,说

明书建议使用浓度在2ug/ml-10ug/ml之间，所以建议稀释200-1000倍，本实验所使用浓度为5ug/ml，即稀释400倍。

二组织采集与处理

材料：

取不同时间点猪的睾丸组织观察精原干细胞的表达，

新生小猪，3-5月龄，成年猪。

采集适龄猪睾丸组织，置于PBS中带回实验室，用PBS清洗若干次，将睾丸白膜去除，组织切成适宜大小，用苦味酸固定过夜，次日进行清洗（PBS）3-4次，每次30min,然后用70%酒精清洗3次，每次30min，储存于70%酒精备用。

包埋：

80%酒精--90%酒精一100%1酒精--100%H酒精各

30min，无水乙醇：

二甲苯1:

12h，二甲苯I,二甲苯H依照所取组织大小确定处理时间，二甲苯：

石蜡1:

12h,石蜡I1h,石蜡

□2h,包埋。

组织切片：

7um,37C烤片5h。

三免疫组化（SP法，各种抗体稀释浓度附于后表）：

1脱蜡：

二甲苯I、□各5min。

复水：

100%乙醇I、□,90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇

各3min，超纯水清洗5min*3次。

2用超纯水配制0.5%的Tritonx-100,室温孵育10min，超纯水清洗3*5min。

3抗原修复：

柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L,pH=6）高压修复：

将玻片同修复液（1L烧杯）一起放入高压锅内，加热加压至125C，修复5min，放气后降温至90C时将烧杯拿出自然冷却至室温。

TBS清洗3*5min;

微波修复：

柠檬酸钠缓冲液加热煮沸，将玻片置入烧杯内，

加热6min，停1min,重复3次，冷却；

煮沸修复：

Tris/EDTA（pH=9）置于1L烧杯中微波炉里加热至沸腾，水浴锅提前加热至99C|。

置入玻片修复10min.自然冷却。

TBS清洗3*5min

43%HQ（试剂盒）孵育10min.,TBS清洗3*5min。

5封闭血清（试剂盒），封闭2h,勿洗。

6一抗稀释：

含3%BSA的TBS置于湿盒，4C过夜。

7次日，取出湿盒，恢复至室温40min,TBS清洗3*5min。

8二抗（试剂盒）室温孵育30min,TBS清洗4*5min。

9辣根过氧化物酶（试剂盒）室温孵育30min,TBS清洗

4*5min。

10DAB显色，用倒置显微镜严格控制显色时间，待背景染色浅，特异性染色深时，终止染色，TBS清洗

2*5min。

11苏木精：

3min，清洗（流水冲一下）后，5%冰醋酸分化

30秒（可短些），流水蓝化5min，脱水（70%,80%,90%,100%I,100%n酒精各1min）,二甲苯透明1min，中性树胶圭寸片。

四免疫荧光染色（各种抗体稀释浓度附于后表）：

100%乙醇I、口，90%乙醇,80%乙醇,70%乙醇

将玻片同修复液（1L烧杯）一起放入高压锅内，加热加压至125C，修复4min，放气后降温至90C时将烧杯拿出自然冷却至室温。

Tris/EDTA（pH=9）置于1L烧杯中微波炉里加热至沸腾，水浴锅提前加热至99C|。

4封闭血清（10%）,使用TBS稀释，封闭2h,勿洗（置于湿盒）。

5一抗稀释：

用含3%BSA的TBS稀释后置于湿盒，4C过夜。

6次日，取出湿盒，恢复室温40min,TBS清洗3*5min。

7荧光二抗：

含3%BSA的TBS稀释，37C（提前打开烘箱）］,30min，避光（以后都注意）RTBS清洗4*5min。

第一次

使用加Tween20（0.05%）的TBS清洗，二，三，四次使用

TBS，每次5min。

8DAPI:

室温10min,TBS稀释，TBS清洗一次即可。

980%甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察。

五免疫双荧光染色［各种抗体稀释浓度附于后表）：

各3min,TBS清洗。

2用超纯水配制0.5%的Tritonx-100,室温孵育10min，超纯水清洗2*5min。

将玻片同修复液（1L烧杯）一起放入高压锅内，加热加压至125C,修复4min，自然降温至90C，放气，将烧杯拿出自然冷却至室温；

Tris/EDTA（pH=9）加热至沸腾，水浴锅调至

99C.置入玻片修复10min.自然冷却。

TBS清洗3*5min

4封闭血清（10%）,TBS稀释，封闭2h，勿洗。

使用含3%BSA的TBS稀释，两种抗体混合稀

释，如要配制50ulTHY1-PLZF抗体，则用50ul抗体稀释液中加1ulTHY1和1ulPLZF。

置于湿盒，4C过夜。

含3%BSA的TBS稀释，两种抗体混合稀释，如需要400ul双荧光二抗，则在400ul抗体稀释液中分别加入1ul488和594,37C,30min，避光，TBS清洗4*5min第一次使用加Tween20（0.05%）的TBS清洗，二，三，四次使用TBS，每次5min。

各种抗体适合修复方法及稀释比例（猪，羊）

种属

抗体

稀释比例（SP法）

卄、|/荧光

修复液

修复方法

猪

PGP9.5（5月）

1:

1000

500

柠檬酸钠缓冲液

咼压

VASA（5月）

400

400:

Tris/EDTA

煮沸

GPR125（3,5月）

100

50

THY1（5天，10天，

3月）

PLZF（10天，3月）

GATA（10天，3月）

DBA（10天）

未作

微波

小鼠

LIN28

200

VASA

未作「

煮沸或咼压

大鼠

PGP9.5（2周）

1500

注意事项：

1组织处理时，组织快不能切太小，否则不能保证切片

数量；

不能切太小，否则透明时间和浸蜡时间不好把握。

切

片厚度以5um或7um为佳，贴片需使用多聚赖氨酸包被的玻片，展片是要把握好展片温度，一般多聚甲醛与苦味酸固定的组织所用温度不同，苦味酸大概所需温度为45C左右，

多聚甲醛为42C左右，展片后要在37C烘烤4-6小时。

2包埋蜡温度不宜过高，以免烫坏组织，切片时易碎，透明时间要依据组织块大小准确把握。

3脱蜡要彻底，复水后使用超纯水将酒精清洗干净，TBS缓冲液和抗原修复液的pH值要准确，否则不利于抗原抗体复合物的形成。

4抗原修复后要自然冷却，切不可立即清洗，易造成脱片，H2O2浓度不能太高，孵育时间不宜太长，否则易脱片。

5血清封闭后勿洗，加一抗前使用离心机将一抗离心，加稀释液后，用枪反复吹打，一定要将一抗混匀。

6次日将湿盒从冰箱拿出后恢复至室温，如若使用了不同抗体，清洗时要分开清洗。

7二抗孵育完后可多次清洗以减少背景，免疫组化后苏木精复染要把握好时间，以免苏木精颜色过深影响免疫组化效果，免疫荧光染色一定要避光操作，孵育时可置于恒温烘箱中，清洗时可用锡箔纸包住染色缸。

作好免疫组化染色必须注意的问题

一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。

因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。

另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。

离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。

标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。

虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。

因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。

、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。

如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。

由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操