浅论原子力显微镜对星形细胞瘤间变性星形细胞瘤的鉴别诊断Word格式文档下载.docx
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肿瘤细胞的生长过程必然伴有细胞膜表面蛋白的改变。
采用AFM对星形细胞瘤细胞和间变性星形细胞瘤细胞进行观察，研究二者细胞膜表面超微结构的差异，为其临床的鉴别诊断提供依据。
1材料与方法
材料和设备
标本全部经HE染色确定为星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的新鲜组织细胞，来源于武警总医院。
各30例；
2％甲醛溶液、苏木素—伊红染液、巴氏染液、酒精、二甲苯。
主要设备：
原子力显微镜（型号为NanoscopeⅢa（DigitalInstrumentsInc.,SantaBarbara,CA），采用NSC—11型针尖；
OlympusBX50光学显微镜；
显微图像分析系统；
超净工作台；
离心机、漩涡混合器。
方法
分别用刮板在收集到的星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤组织上进行取样，并将采集了瘤细胞的刮板放入装有2％甲醛溶液的试管中，在试管上做好标记，摇荡刮板使细胞标本洗脱在溶液中，去除刮板后固定20min，用200目钢网过滤，去除组织残块和细胞团，放入离心机，1500r／min离心15min，缓缓倾去上清液，再用2％甲醛溶液洗涤、离心、弃上清液反复3次，加少许2％甲醛溶液将沉淀的细胞用漩涡混匀器混匀，将细胞悬液涂于洁净的载玻片上，置于洁净空间晾干备用。
AFM观测将样本晾干后置于AFM载物台上，利用Nikon倒置显微镜观察细胞的分散情况，选择细胞分散较好的区域进行扫描。
最大扫描范围100μm，用200μm长的Si3N4微悬臂，采用轻敲模式,图像采集为恒力模式。
调整激光与针尖重合，并将探测器的激光光斑置于中心圆点。
在操作软件下进行自动调频，然后下降探针，直至针尖接触到样本，开始扫描。
此时计算机显示该细胞相应的图像，此图像可以进行测量和保存。
每例样本扫描10个细胞，扫描范围为500nm～100μm,扫描频率为～2Hz。
选细胞膜表面颜色最亮、突起最大最密集的区域测量，所选细胞测量范围均为1μm，每一组各测量300个区域。
并利用AFM图象分析软件对每个1μm区域的平均粗糙度、峰值、表面积差值进行分析。
并获取3种参数的具体测量值，采用软件对这而种细胞的3种参数值进行方差分析,比较细胞间是否有差别。
2结果
细胞形态观察结果
星形细胞瘤细胞表面呈现层状排列的皱褶结构，胞体间见大量粗细不一的胞突，有时难以分辨它们的所属细胞。
间变性星形细胞瘤细胞密度大，胞膜表达不光滑皱褶结构更为明显，瘤细胞胞突少，长短不一，但主要为较短小突起。
细胞膜AFM下纳米水平表现
利用AFM的图像分析软件系统对星形细胞瘤细胞、间变性星形细胞瘤细胞细胞膜表面重要指标即平均粗糙度、峰值和表面积差值进行测量与分析。
与星形细胞瘤细胞比较，间变性星形细胞瘤细胞的平均粗糙度升高，峰值增加，表面积差值变大，具有显着性差异（）。
因此可通过这三者的差异对星形细胞瘤和间变性星形细胞瘤进行鉴别诊断。
表1细胞膜表面结构变化组别n平均粗糙度峰值表面积差值星形细胞瘤间变性星形细胞瘤
3讨论
目前，国内外文献报道中，对于星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的鉴别诊断方面的研究，主要集中在影像学和分子生物学技术。
如CT和MRI可利用灌注成像来对肿瘤的性质进行估计[7，8]。
再如，应用分子生物学技术检测星形胶质细胞瘤细胞中端粒酶、PCNA、Ki-67、ckit、MGMT等相关分子[9-13]的表达。
但是都无法从细胞的纳米级别的形态学上观察细胞的形貌差异。
原子力显微镜是近十几年来发展起来的超微表面分析成像技术。
它可以对经典透射电镜和扫描电镜技术无法观测到的非导电材料表面纳米尺度结构进行原子水平成像和调控[14，15]。
其横向分辨率达到～nm，纵向分辨率达到nm，近年来逐渐被应用于生物医学领域研究。
它可以在接近生理状态下在纳米尺度对组织、细胞、微生物、DNA、蛋白质[16，17]等各种生物样品进行成像和操纵。
因此AFM不仅在基础医学研究领域越来越受到人们的关注!
并且已逐步向临床应用过渡。
利用原子力显微镜通过对细胞进行扫描，从细胞形态学方面进行肿瘤细胞良恶性的鉴别诊断，此方法更加简便快捷，诊断准确率进一步提高，对肿瘤细胞的进一步研究也有着重要意义。
在本实验中应用AFM对星形细胞瘤细胞、间变性星形细胞瘤细胞的细胞形态进行观测，发现无论分化程度如何，瘤细胞表面均有不同程度的皱褶，大小不等、粗细不一的胞突，且分化越好，突起越多，细而长。
利用AFM图像分析软件测量细胞膜表面微细结构，星形细胞瘤细胞膜表面的平均粗糙度、峰值、表面积差值3种数据都明显低于间变性星形细胞瘤。
3种数据反映了细胞膜表面蛋白的分布情况，数值越大代表膜表面的蛋白越多。
这与其功能是相对应的，从星形细胞瘤细胞到间变性星形细胞瘤细胞，细胞的活跃程度是逐渐升高的，因此可以判定细胞的活跃程度的增加即可表现在细胞膜表面蛋白的变化上，蛋白的数量随之增多。
该实验可清晰的观察到细胞膜表面蛋白的变化情况，证明了细胞膜表面蛋白的数量又代表着其功能状态的活跃程度。
因此，本实验从形态学出发，借助AFM能够清晰呈现细胞膜表面纳米级结构的绝对优势，以星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的细胞为研究对象，观察并分析细胞膜表面特异性的形态学变化和差异，为临床的星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤的鉴别诊断提供向导。
本研究表明AFM可以在纳米尺度对细胞膜表面蛋白进行直观的三维成像，并通过AFM图像分析软件系统对细胞膜表面重要指标进行测量和分析，近年来随着原子力显微镜新的操作模式的相继出现[18]，使得AFM测得的情况更接近真实情况，将会为临床诊断提供
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