细胞工程知识点及重点难点总结.docx

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细胞工程知识点及重点难点总结

第一章绪论

1、细胞工程的概念，广义的细胞工程，狭义的细胞工程，

⏹细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。

⏹广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。

2、细胞工程的研究内容（研究生物类型，实验操作对象）

⏹根据研究生物类型不同，细胞工程可分为动物细胞工程、植物细胞工程、微生物细胞工程。

⏹动物细胞工程包括：

细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。

⏹植物细胞工程包括：

植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。

3、细胞工程的重要应用（植物、动物）

⏹植物细胞工程的应用：

脱毒和快速繁殖

细胞工程育种：

利用培养变异，筛选优良突变体

利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性

利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性

倍性育种

离体种质保存

细胞培养生产有用物质

⏹动物细胞工程的应用

动物细胞培养生产医药产品（单克隆抗体）

新品种培育

试管动物与婴儿

组织工程

珍稀动物资源的保存与保护

第二章细胞工程基础

1、细胞分化：

个体细胞发育过程中，后代细胞在形态、结构和生理功能上发生差异的过程。

2、发育潜能：

指细胞分化能力的强弱。

3、细胞全能性：

指细胞具有发育成完整个体的潜能。

4、细胞多能性：

指随着胚胎发育，有的体细胞失去全能性，具有分化出多种组织的潜能。

5、去分化：

又称脱分化，指某些条件下分化细胞不稳定，又回到未分化状态的这一过程

6、愈伤组织：

脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。

愈伤组织的种类

胚性愈伤组织（Embryoneniccallus）：

表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。

胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。

非胚性愈伤组织：

表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。

第三章细胞工程实验室及实验基本操作（教材第二章）

1、什么是灭菌？

是么是消毒？

（P18）

灭菌是指杀灭或者去除物体表面和孔隙内的所有微生物，包括抵抗力极强的细菌芽胞。

消毒是指杀死物体上的病原微生物，但细菌芽胞和非病原微生物可能还存活。

2、常用的灭菌和消毒方法有哪些？

物理法

（一）紫外线

直接照射、表面灭菌、可消毒空气和培养用具（如塑料器皿），消毒的效力和距离有密切关系，故无菌室天花板一般不宜太高。

一般石菌室内空气、桌椅以及培养用具在紫外线有效消毒距离内，照射30分钟，可达到灭菌效果。

紫外线照射使用方便、消毒效果好；缺点是能产生臭氧，污染空气，且对未直接照射的部分无消毒效果。

（二）干热消毒

主要用于消毒玻璃器四周，干热、消毒的器皿干燥，易贮存。

但干热传导慢，需加温到160℃，保持90~120分钟，才能杀死芽孢，达到消毒目的。

消毒后不要立即打开箱门，防止冷空气忽然进入影响消毒效果和损坏玻璃器皿。

金属器械和橡胶制品不能用于干热消毒等。

（三）湿热消毒

即高压蒸气消毒，是最有效的一种方法。

布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某种液体都可以用这种方法。

（四）滤过消毒

不能高温高压灭菌的液体可以用此法，如动物组织的人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶系。

须选一定规格的滤器，液体滤过速度，且保证除菌效果的关键。

一般以肉眼可见液滴滴下为。

滤过后及时分装。

（五）煮沸消毒

急需要时的常规方法，金属器械、胶塞在水中煮沸20~30分钟，趁热倒去水分即可使用。

化学法

（一）消毒剂灭菌

来苏尔、新洁尔灭（1%）、70~75%酒精、安替福氏、贝氯酸钙、乳酸蒸气、环氧乙烷。

（二）抗菌素灭菌：

（三）熏蒸灭菌

3、什么是平衡盐溶液（BSS）？

平衡盐溶液（BalancedSaltSolution；BSS）

又称生理盐水或盐溶液。

具有维持渗透压，控制酸碱度的平衡作用，同时也能供给细胞中生存所需的能量和无机盐离子，用作冲洗组织和细胞，配制各种培养用液的基础溶液，也可用于短暂培养。

成分：

水，无机盐，葡萄糖组成。

4、什么是生物安全实验室？

目前，生物安全实验室的种类有哪些，各有什么特点。

5、动物细胞培养的天然培养基有哪些？

天然培养基

1．血浆

最常用的是鸡血浆，它具有一定的营养，与少量鸡胚浸出液混合后，有良好的凝固作用，利于支持细胞的生长。

缺点易液化，一般常用作各种细胞生长的基质。

2．鼠尾胶原

对维持细胞生长有良好作用。

由于鸡血浆存在一定缺点，人们曾试用了很多化药品，其中鼠尾胶原较好。

它能促进组织和细胞的附着，改善生长表面药性。

来源：

燃尾键，豚鼠真皮，牛的真皮和牛眼的水晶体，实验室常用大鼠尾制胶原。

3．胚胎浸出液

主要成分是大分子核蛋白和小分子氨基酸，有刺激细胞生长的作用。

在动物、细胞培养中应用最早，但由它而作了变到使用合成培养液，并渐渐被合成培养液所代替，但在研究中仍有应用价值。

常用的有鸡胚和牛胚。

4．血清

是动物用量最大的天然培养基。

血清含有丰富的营养物质，包括大分子的蛋白质和核酸。

动物细胞的生长和增殖需要血清。

实验证明血清对细胞附着和保护尚有明显作用，且能中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害。

血清种类很多，其中有小牛血清、胎牛血清、马血清、人胚胎血清等，胎牛血清比较理想，但不易得到。

目前各实验室多采用小牛血清。

目前已有出售小牛商品血清。

人血清一般都采用AB型血清，但价格昂贵，很少用。

5．血清代用品

血清的来源比较困难，而且成分复杂，人们努力寻找其替代品，其中有聚乙烯、吡咯咆酮（P、V、P）、蛋白胨、水解乳蛋白等，但都不如血清，因而没广泛使用。

第四章植物组织器官培养技术（教材第四、七、八章）

1、离体无性繁殖（propagationinvitro）：

利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。

也称之为微繁（micropropagation）、快速繁殖（rapidcloneprogagation）。

2、繁殖系数（breedingcoefficient）：

也叫增殖率，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数.

3、简述离体无性繁殖的程序。

（1）无菌培养物制备，包括：

外植体的选择－外植体灭菌－接种－培养等基本过程。

（2）培养物的增殖

腋芽增殖：

培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖

不定芽增殖：

繁殖系数高，非洲紫罗兰用常规叶插法，每片叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一次形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个小植株。

遗传稳定性较好。

但继代次数有限。

培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。

此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。

诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多的愈伤组织。

以保证繁殖品种的遗传稳定性。

胚状体增殖：

增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。

目前除一些特殊用途外（人工种子），这一途径还没有用于快繁技术。

愈伤组织增殖：

所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。

这一途径经历了组织培养技术的所有过程（愈伤组织诱导－愈伤组织增殖－芽分化－生根－完整植株），它属于真正意义上的组织培养。

一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。

其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。

对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁

原球茎增殖：

细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。

大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。

原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。

（3）生根培养：

一种是在固体培养基上诱导生根。

当试管苗长到2～3厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定）

另一种是浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。

（4）炼苗和移栽：

将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。

一般炼苗时间为2—3d。

移栽时应注意的问题：

a、防止菌类滋生；b、保持小苗水分供给平衡

（5）再生植株的鉴定

4、简述当前脱除植物病毒的方法及原理。

茎尖培养脱毒法；热处理脱毒法；微体嫁接离体培养脱毒法；珠心组织培养法；愈伤组织脱毒

茎尖脱毒：

依据：

病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。

热处理脱毒法：

①热处理不能杀死病毒。

只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去浸染能力。

②热处理是一种物理效应，可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。

微体嫁接离体培养脱毒法：

同茎尖脱毒。

珠心组织培养法：

一般认为病毒是通过维管组织传播的，珠心组织与维管系统没有直接联系，

因此珠心组织培养可获得无病毒植株。

愈伤组织脱毒：

病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。

5、简述脱毒效果如何检测

A指示植物鉴定（indicatortestplants）所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。

每种病毒都有自己敏感的植物，指示植物鉴定病毒的方法：

a.摩擦接种法：

通过汁液传播的病毒，

b、嫁接法：

通过专门的介体传播的病毒，

B血清鉴定（serologictest）试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定（ELISA）。

C电镜检查法

采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病毒存在，还可以进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法即准确又有效，但需要有一定的设备和技术。

D分子检测法

例如RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReation）将待测的样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达

6、脱毒苗的保存与繁殖。

⏹脱毒苗的离体保存与繁殖:

一般是在实验室进行，一般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，如B9和矮壮剂可2-3个月继代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存。

⏹建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：

如果试管苗生产成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定的控制区域，从繁殖技术和环境隔离上保证较高水平，使得繁殖的种苗能有效的防止病毒的再侵染。

7、什么是花药培养？

什么是花粉培养？

8、花药培养的基本程序是：

外植体选择－外植体（花蕾）预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养-移栽

9、花药培养中如何选择外植体？

⏹基因型的选择

通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。

同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的。

因此在进行花药和花粉培养时，应选择