细菌的消毒防腐剂耐药基因研究进展文档格式.docx

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　　ABSTRACTAntisepticresistancehasarisenmoreandmoreattention，andthecrossresistancebetweenantisepticsandantibioticsisagreatproblemwefocuson.Nowitisshownthatthebacterialresistanttoantisepticssuchasquaternaryammoniumcompounds（QACs）andchlorine��releasingagents（CRAs）hasrelationshipwithgenes.ThefollowingarticleisareviewfortheprogressontheantisepticresistancegenesuchasqacandmerA.

　　KEYWORDSBacteria;

Antiseptics;

Drugresistance;

Gene

　　消毒防腐剂在生活中的应用和发展已有几个世纪。

从经验性地用铜和银打造的容器来储存饮用水，用醋和蜂蜜清洗伤口，用香料保存鱼和肉，到用碘酒作为伤口消毒剂，在产科中应用含氯水溶液，将苯酚作为伤口敷料以及在外科中作为抗菌剂，和将二价汞离子用作杀芽孢剂，整个消毒防腐剂都处在不断的发展之中。

20世纪初人类又进一步开发了双胍类（CRAs）和季胺类消毒剂（quaternaryammoniumcompounds，QACs）。

到了20世纪40年代，常用的消毒防腐剂已有酚类化合物、有机汞、双胍类消毒剂、季胺类消毒剂、碘及其复合物、乙醇、甲醛、过氧化氢、银化合物、染料（如吖啶、三苯甲烷）和两性表面活性剂。

直到目前，这些消毒剂中的大多数仍在广泛地使用［1］。

尽管消毒防腐剂一直在更新换代之中，但是在其广泛的选择压力下，细菌仍然渐渐产生了耐药性。

因此，又一新的挑战已经摆在医务人员面前。

现已发现，细菌对季胺类、双胍类以及重金属等消毒防腐剂的耐药与细菌本身的耐药基因有关。

本文对细菌的消毒防腐剂耐药基因研究进展综述如下。

1季胺类消毒剂耐药基因（qac）

　　细菌的季胺类消毒剂耐药基因首先从葡萄球菌属中分离得到。

因其编码的蛋白介导对季胺类消毒剂耐药，从而命名来源于此。

目前该类消毒剂耐药基因有qacA、qacB、qacC、qacG、qacH、qacF、qacJ、qacE和qacEΔ1。

　　1.1qacA/B

　　qacA多重耐药基因qacA首先在20世纪80年代从多重耐药的携带β�材邗０访负�金属离子耐药基因的质粒pSK5中分离得到，随后英国和澳大利亚也在金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌中发现携带qacA基因的pSK1家族质粒和pSA1379质粒的流行［2，3］，之后在细菌的染色体上也发现qacA基因的存在［4］。

Rouch等［5］研究表明，qacA基因与四环素耐药基因tet和糖转运体基因有高度的同源性。

　　核酸序列分析表明，qacA基因编码514个氨基酸的多重耐药Mr55017外排蛋白（QacA）。

该蛋白含有14个α�猜菪�的跨膜片段（transmembranesegments，TMS），属于主要易化子超家族（themajorfacilitatorsuperfamily，MFS），依赖质子泵动力把菌体吸收的药物排到体外，介导对30多种结构不同的有机化合物包括单价阳离子化合物（如季胺类化合物和染料）和二价阳离子化合物（如联脒和丙脒腙）耐药［6］。

经流式细胞仪检测，发现单价和二价阳离子化合物作用在QacA蛋白不同靶位上［7］。

另有研究表明，其中第10个α�猜�旋的跨膜片段是QacA蛋白袋状结构域的酶作用底物完整的结合位点，其中323��天冬氨酸残基和319�布琢�氨酸残基是二价阳离子化合物的直接结合位点。

313�哺拾彼岵谢�被认为在底物转运过程中起了非常重要的作用。

通过诱变试验表明，多重耐药QacA蛋白的袋状结构域作用位点极易发生适应和突变［8］。

　　现在公认，作为qacA的上游基因qacR所编码的蛋白可抑制qacA转录。

该蛋白属于TetR/CamR转录调控家族，是有188个氨基酸，分子量为22.8ku的二聚体。

TetR/CamR家族成员具有相似的三螺旋N端DNA结合结构域和反向的C端结构域，这些结构特点能结合特异蛋白形成复合物，而且大多数TetR/CamR家族成员结合由0～15bp的DNA序列编码二聚体调控子。

QacR能在qacA启动子区结合一段较长的序列（IR1，包括28bp），其覆盖的范围包括qacA的转录起始位点［9］。

QacR与IR1以两个二聚体形式结合，并且QacR可能作为抑制因子与IR1结合形成DNA蛋白复合物，阻止RNA聚合酶��启动子复合物往前移动生成RNA，而不是阻断RNA聚合酶与启动子的结合［9～11］。

QacR蛋白由很多结构不相似的单价和二价亲脂性阳离子化合物诱导产生，这些化合物同时也是QacA外排泵酶的作用底物，如果这些化合物的其中之一结合到QacR蛋白任何一个二聚体上，将导致QacR蛋白由线状到螺旋状转变，最终导致蛋白内部的92�埠�93��酪氨酸残基排到蛋白外面，形成药物结合袋状结构域。

这些重要的构像变化将导致螺旋α5的一次延伸，并促使螺旋α6在DNA结合区域易位。

螺旋α6与螺旋α1的DNA结合区域有很多复杂的相互作用关系，它的活动可导致DNA结构域结合的药物亚基发生平移和旋转，分别为9.1��和36.7°

；

游离的药物结合亚基仅发生很小的平移和旋转，分别为3.9和18.3°

。

这些构像变化的结果是使得DNA识别的螺旋中心距离变大了9��，最终导致该结构不再结合到IR1的位点上去，使得qacA基因开始转录［12］。

　　qacB早在20世纪50年代，国外学者就已经从澳大利亚的一家医院临床分离的金葡菌中提到携带qacB基因的质粒pSK156，这是最早分离到的已知编码外排泵蛋白的质粒［8］。

此后，80年代时又在金属离子高度耐药的质粒pSK23中也发现存在qacB［13］。

基因测序和诱变试验研究表明，与qacA基因相比，两者之间仅仅是7个碱基和第十个跨膜片段323位的氨基酸不同，qacA为天冬氨酸，qacB为丙氨酸，因此不能用PCR和Southernblot的检测方法对它们进行鉴别。

这种差异被认为是由于临床上长期应用二价化疗药物而诱导形成的。

现在发现，与QacA不同的是，QacB仅对单价阳离子化合物耐药，对少数的二价阳离子化合物呈低度耐药［8］。

　　1.2qacC

　　qacC基因又名qacD、ebr或smr，可从金葡菌小质粒和大质粒如2.4kb的pSK89、pSK108和47.8kb的pSK41中分离得到［13］；

在凝固酶阴性葡萄球菌的结合型质粒PNVH99中也发现它的存在［14］。

后来从食品中分离得到的葡萄球菌经核酸测序证明，qacC与smr仅有一个核苷酸的不同。

qacC基因编码的蛋白含有107个氨基酸，属于原核多重耐药家族，这个家族中还包括大肠埃希菌编码蛋白Ebr和革兰阴性杆菌的整合子编码蛋白QacE。

该家族的蛋白均有四个跨膜片段，它们依靠质子泵的动力对季胺类化合物和溴化己啶等消毒剂耐药［15］。

Paulsen等进一步研究表明，QacC蛋白四个跨膜部分均为α螺旋，四个部分分别由膜外周质的两个区域和膜内的一个区域分隔开来（图1）。

通过定向诱导试验发现，用具有相同侧链的甘氨酸和丙氨酸取代QacC蛋白的保守残基31�哺�氨酸、59��酪氨酸和62�采�氨酸，能明显地降低对乙啡啶和甲基玫瑰苯胺的耐药水平。

以上现象表明，这些氨基酸应该处在酶特异性结合位点的边缘。

而且59�怖野彼岷�62�采�氨酸的替换几乎能降低对绝大多数消毒剂的耐药水平，因此59�怖野彼岷�62�采�氨酸在酶结合位点起了非

　　图1　　QacC蛋白模型图常重要的作用［16］。

　　1.3qacG

　　qacG基因是1999年从具有2.3kb碱基的质粒pST94中分离得到的。

该基因编码的蛋白QacG有107个氨基酸，与Smr、QacE和EmrE的同源性分别是69.2%、45%和41%，属于小的多重耐药家族（thesmallmultidrugresistancefamily，SMR），其耐药机制也是依赖质子的外排泵。

与Smr蛋白不同的是，QacG蛋白的第33号氨基酸被分散地贯穿于整个蛋白，而Smr蛋白仅处在第二个α螺旋内。

与Smr蛋白相同的是，QacG蛋白的疏水性氨基酸和Smr疏水性氨基酸处于相同的位置，具有同样的蛋白折叠结构。

这两个蛋白均有两个保守区域，分别是第38号氨基酸到47号氨基酸和52号氨基酸到71号氨基酸，这两个区域分别在Smr蛋白结构模型中第二个跨膜片段的羧基末端和第三个跨膜片段的氨基末端上。

多重氨基酸序列对比研究表明，小的多重耐药家族成员拥有许多的保守序列。

在QacG蛋白中，大多数残基被认为是保守的，但是有两个例外：

9�脖�氨酸被替换为丝氨酸和32�菜堪彼岜惶婊晃�苏氨酸。

与Smr蛋白相比，QacG蛋白中大约一半的氨基酸替换被认为是保守的，包括疏水氨基酸的替换，如亮氨基酸�惨炝涟滨；

�、缬氨酸��异亮氨酸和苯丙氨酸异亮氨酸。

总之，与Smr蛋白相比，它的33个氨基酸替换并没有使它的耐药谱发生太大的变化。

两者均对苯扎氯铵（benzalkoniumchloride，BC）耐药，但是QacG却对吖啶变得敏感，而且对磷酸三苯酯、罗丹明6G、二氨基吖啶、盐酸四环素和联二��n�布谆�吡啶（MV）始终保持敏感［17］。

　　1.4qacH

　　1998年，Heir等从腐生葡萄球菌中分离得到一个2.4kb的质粒p2H6，其中含qacH基因。

核酸测序结果表明，完整的质粒p2H6有一个开放读码框负责编码含107个氨基酸的蛋白，并与小的多重耐药家族蛋白有高度同源性。

进一步作氨基酸测序表明，QacH与Smr、QacG分别有78%和70%的同源性。

与Smr和QacG不同的是，QacH对二氨基吖啶呈低水平耐药，对溴化乙啡啶高度耐药。

将qacH基因克隆到与qac相同的质粒上作进一步研究，结果表明，qacH基因的启动子也是自身内在的基因。

由此可见，QacH与Smr、QacG一样，都有广泛的耐药谱。

经荧光素标记法显示，QacH对溴乙啡啶高度耐药也是质子泵所介导的。

定向诱变替换试验表明，以24�补劝滨０�替换24�蔡於�氨酸并不能在耐药特征上产生很大的改变。

同时，在p2H6质粒上还有另外一个开放读码框来编码一个与滚环复制蛋白类似的未知蛋白［18］。

　　1.5qacJ

　　qacJ基因是Bjorland等2003年在挪威从马身上的金葡菌分离质粒pNVH01中得到的。

同时，在中间葡萄球菌（S.intermedius）和模仿葡萄球菌（S.simulans）上也发现存在质粒pNVH01。

pNVH01质粒拥有2650bp碱基，是环状DNA复制机制的pC194质粒家族一员。

Bjorland等对qacJ作核酸测序，再与小的多重耐药家族蛋白比较，发现它们有较高的同源性，并据此认为QacJ蛋白也属于小的多重耐药家族。

该基因编码的蛋白有107个氨基酸和4个跨膜片段。

与Smr相比，QacJ对苯扎氯铵的耐药增强，但对溴化十六烷基三甲铵（cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）敏感度一样。

以上结果表明，酶作用底物的改变系由单个氨基酸改变所致，而不是因为qacJ基因转录时发生突变引起。

经与Qac