过氧化氢酶活力的测定实验报告docWord格式.docx

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3.酸式滴定管；

4.恒温水浴；

5.容量瓶。

　　（三）试剂：

1.10%H2SO4；

2.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液；

3.0.1mol/L高锰酸钾标准液称：

取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L草酸溶液标定；

4.0.1mol/LH2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/LKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；

5.0.1mol/L草酸：

称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。

　　三、实验步骤

（一）酶液提取：

取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，当即加入10%H2SO42.5ml。

　　用0.1mol/LKMnO4标准溶液滴定，至显现粉红色（在30min内不消失）为终点。

　　四、结果计算

　　酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：

　　过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×

VT/（W×

VS×

1.7×

t）

　　式中：

A对照KMnO4滴定ml数；

B酶反映后KMnO4滴定ml数；

VT提取酶液总量（ml）；

　　VS反映时所用酶液量（ml）；

W样品鲜重（g）；

t反映时刻（min）；

　　1.71ml0.1mol/LKMnO4相当于1.7mgH2O2。

　　过氧化氢酶的活性测定

　　在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包括H2O2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸

　　作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。

H2O2的积存可致使破坏性的氧化作用，

　　而过氧化物酶和过氧化氢酶那么能够清除H2O2，

是植物体内重要的活性氧清除系统之一。

其活

　　性还与植物的抗逆性有紧密关系，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。

　　一、原理：

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，

　　在此进程中起传递电子的作用，H2O2那么既是氧化剂，又是还原剂。

　　R（Fe+2）＋H2O2=====R（Fe+3OH-）2

　　R（Fe+3OH-）2＋H2O2===R（Fe+2）2＋2H2O＋O2

　　归并上式：

2H2O2====2H2O＋O2

　　据此，可依照H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

　　在反映系统中加入必然量（反映过量）的过氧化氢溶液，经酶促反映后，用标准高锰酸

　　钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。

　　5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4

　　即可求出消耗的H2O2量。

　　二、仪器和用具：

研钵、三角瓶50cm3×

4、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶

　　三、试剂：

　　10％H2SO4；

0.2mol/l磷酸缓冲液pH7.8；

　　0.1mol/l高锰酸钾标准液：

3.1605gKMnO4（AR）用新煮沸的蒸馏水配制成1000ml，用

　　0.1mol/l的草酸溶液标定；

　　0.1mol/lH2O2：

市售30％H2O2大约等于17.6mol/l，

取30％H2O2溶液5.68ml稀释至

　　1000ml，用标准0.1mol/lKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。

　　四、方式：

　　1.酶液提取：

取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml

　　容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm离心，

　　上清液即为过氧化氢酶粗提液。

　　2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液

　　2.5ml；

再加入2.5ml0.1mol/lH2O2，同时计时刻，于30℃恒温水浴中保温10分钟，当即加

　　入10％H2SO42.5ml。

　　3.用0.1mol/lKMnO4标准溶液滴定H2O2，至显现粉红色（在30分钟内不消失）为终点。

　　4.结果计算：

　　酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数表示：

　　（A-B）*Vt/V1*1.7

　　酶活（酶分解的H2O2mg/g鲜重）＝-------------------

　　W

Ａ-----对照用KMnO4ml数Ｂ-----酶反映后KMnO4滴定ml数

　　Ｖt----酶液总量mlＶ1----反映所用酶液量mlＷ-----样品鲜重（g）

　　1.7----1ml0.1mol/lKMnO4相当于1.7mgH2O2

　　[注意]．所用KMnO4溶液及H2O2溶液利用前要通过标定，0.1mol/lH2O2要新配制。

　　实验48过氧化物酶活性的测定（比色法）

　　过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密

　　切关系，在植物生长发育进程中，它的活性不断发生转变，因此测量这种酶，能够反映某一时期植物体内代

　　谢的转变。

　　一、原理

　　在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，

　　可用分光光度计测量470nm的吸光度转变测定过氧化物酶活性。

　　二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

　　马铃薯块茎。

（二）试剂

　　1．100mmol／L磷酸缓冲液pH6.0（见附录）。

　　2．反映混合液：

100mmol／L磷酸缓冲液（pH6.0）50mL于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于

　　磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保

　　存于冰箱中。

　　（三）仪器设备

　　分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容量瓶，吸管，

离心机。

　　1．称取植物材料1g，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000r／min离心15

　　min，上清液转入100mL容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至

　　刻度，贮于低温下备用。

　　2．取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反映混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只

　　中加入反映混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性太高可稀释之），当即开启秒表记录时刻，于分光光

　　度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔1min读数一次。

　　以每分钟吸光度转变值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·

g（鲜重）]表示之。

也能够用每min内

　　A470转变0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）表示。

　　过氧化物酶活性[u/（g·

min）]=

ΔA470——反映时刻内吸光度的转变。

W——植物鲜重，g。

　　VT——提取酶液整体积，mL。

　　Vs——测按时取用酶液体积,mL。

　　t——反映时刻，min。

　　蒲圻贝母FritillariapuqiensisG.D.Yuet

G.Y.Chen是贝母属中一新种，其有效成份生物碱含量较高，止咳成效显著［1，2］。

其中的蒲贝酮碱的成效与可待因相似，且无成瘾性，已被国家新药办立项进行一类新药开发。

但由于蒲圻贝母以野生为主，连年的采挖已使其资源慢慢枯竭，难以为新药开发提供资源保证，为此咱们对其进行了组织培育。

蒲圻贝母鳞茎切块培育22d左右，可直接从切片边缘长出多个小鳞茎，以后小鳞茎慢慢长大。

为了探讨鳞茎发生的机理，并为研究提高组培贝母鳞茎的生长率，诱发多鳞茎形成的方式，咱们在培育的不同时期取材，对鳞茎形成进程中的可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶的酶谱转变进行了分析。

　　1材料和方式

　　1.1材料

　　蒲圻贝母F.puqiensis取自湖北省蒲圻市，经中国药科大学生药教研室李萍博士鉴定。

　　新鲜的蒲圻贝母鳞茎在流水下冲洗3h，0.1%氯化汞表面消毒20min，无菌水冲洗5次，切成0.5cm×

0.5cm×

0.2cm的小块接种于MS附加BA2mg/L-1，IAA1mg/L-1的培育基上，在25℃黑暗条件下培育，取得无菌材料。

别离在培育的不同时刻取材，并以未进行培育的新鲜贝母鳞茎为对照，进行可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱分析。

　　1.2方式

　　1.2.1试剂的配制与凝胶的制备：

参考文献［3］的方式。

分离胶浓度为7.5%，距离胶浓度为2.5%。

　　1.2.2样品制备：

称取新鲜的贝母鳞茎1g，在低温冰箱内放置1h后，加少量石英砂，加3ml提取缓冲液（0.1mol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液，其中含0.5mol/L蔗糖，0.06mol/L抗坏血酸，0.006mol/L半胱氨酸），在低温下研磨后离心20min，5000r/min，取上清液置-20℃下保留。

　　1.2.3

电泳：

采纳垂直板式聚丙烯酰胺凝胶电泳，加入溴酚蓝作为指示染料。

稳固电流强度为12～24mA。

可溶性蛋白的点样量为50μl，用含0.05%考马斯亮蓝的12.5%三氯乙酸溶液染色4h。

过氧化物同工酶的点样量为30μl，用抗坏血酸-联苯胺染液染色，其组成为抗坏血酸70.4mg，联苯胺贮存液20ml（2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加水72ml），0.6%过氧化氢20ml，水60ml。

酯酶同工酶的点样量为50μl，按薛应龙［4］方式，即凝胶在0.2mol/L，Tris-HCl缓冲液（pH7.1）预浸10min，然后移入含有7%醋酸-α-萘酯的丙酮溶液0.5ml，坚牢蓝12.5mg，0.2mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.1）1ml，水23.4ml的染色液中染色10～30min，棕红色的同工酶谱带即呈现。

　　2结果与分析

　　按谱带颜色的深浅程度将其划分为重带、次重带、轻带，并按迁移率的大小划分为3个区，Rf在0.1～0.3为慢速区（A），在0.4～0.6为中速区（B），在0.7～0.9为快速区（C）。

篇二：

过氧化氢酶活性的测定

　　华南农业大学实验报告

　　专业班次11农学一班组别XX30010110