兔骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养体内成软骨的实验观察Word格式文档下载.docx
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【关键词】软骨细胞；
骨髓基质干细胞；
共同培养；
PGA
0引言
软骨缺损与损伤一直是外科临床治疗的难题，组织工程技术为软骨缺损的修复提供了新方法［1］.目前多采用自体软骨细胞移植修复软骨缺损［2］，但效果并不理想.骨髓基质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，在体外特定的诱导条件下可分化为骨、软骨等组织［3-4］.诱导因子及软骨微环境是影响MSCs成软骨分化及软骨形成的主要因素.我们利用少量软骨细胞，通过共培养方法诱导MSCs在体内形成成熟的软骨组织，为进一步的实验研究提供理论依据.
1材料和方法
材料新西兰兔15只，5～6mo龄，雌雄不限，体质量（±
）kg；
新生新西兰兔2只；
DMEM培养液、胎牛血清；
胰蛋白酶；
II型胶原酶；
PGA；
倒置显微镜；
CO2孵箱.
方法
兔MSCs的分离培养将出生1～3d的新西兰兔处死，无菌操作下取其四肢的长骨，用注射器抽取长骨内骨髓，加含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基吹打制成单细胞悬液，分装于2个25mL培养瓶中，取少量细胞计数.在37℃,5mL/LCO2及饱和湿度条件下静止培养5d.第6日首次细胞换液，以后每2～3日换液1次.待第10～14日贴壁细胞长满瓶底部后用g/L胰蛋白酶和1mL/LEDTA的混合溶液消化并传代培养细胞.
兔软骨细胞的分离与培养将出生1～3d的新西兰兔处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取出软骨，将软骨切成1～3mm3大小置无菌试管，PBS冲洗3次，800r/min离心3min，吸去PBS，加2g/L胰酶4mL，置5mL/LCO2孵箱30min，吸出胰酶后再加入2g/LII型胶原酶5mL，置孵箱内消化6~8h.观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800r/min离心3min，用培养液洗2次.细胞记数后移入25mL培养瓶中，使细胞密度为2×
104/L，加DMEM培养液（含100mL/L胎牛血清，1×
105U/L青霉素，50mg/L维生素C，g/L谷氨酰胺），于37℃，5mL/LCO2孵箱中培养，每2日换液1次.原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养.
聚羟基乙酸支架的处理PGA无纺网支架材料的纤维直径15μm，平均间距150～200μm，孔隙率97%，厚2mm.将PGA支架切成5mm×
5mm大小，750mL/L乙醇浸泡12h，无菌PBS冲洗3遍，放入90mm无菌培养皿中干燥，用前用紫外线照射30min.
细胞与PGA支架的复合将MSCs与软骨细胞按3∶1比例混匀，调整细胞密度为×
1010/L.将混合细胞、软骨细胞及MSCs分别接种于经培养液预湿的塑形PGA上，以细胞悬液刚好不溢出材料为宜.在37℃，5mL/LCO2，饱和湿度培养箱中孵育4h，然后在复合物周围滴加含100mL/L胎牛血清DMEM培养液4mL，继续孵育4h，再加入10～15mL培养液，以后每48h换液1次，培养1wk.倒置显微镜下观察细胞生长及附着情况.
实验分组及复合物种植实验分为A，B，C3组，每组各5只.3组分别接种细胞密度为×
1010/L的混和细胞、软骨细胞和MSCs.将兔麻醉后背部一侧脱毛，无菌条件下切开皮肤，适当分离切口一侧皮下组织，将细胞PGA复合物种植于远离切口的皮下.
组织学评价在细胞PGA材料复合物种植后第8周取材，行大体标本观察和HE，Masson三色染色检查，对工程化软骨进行组织学评价.
2结果
细胞形态观察①MSCs培养:
MSCs呈纺锤形或梭形，原代呈集落样生长，接种后8～10d可达80%以上的融合，此时细胞相互间紧密贴附，单个细胞呈狭长梭形，从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列.传代培养后细胞不再以集落方式生长，而是以均匀分布的纺锤形细胞形态平均生长（图1A）.②软骨细胞培养:
原代细胞一般12～24h贴壁，48h后开始增殖.细胞刚贴壁时仍为圆形，伸展后呈多角形，多以类似于同源细胞群的生长方式形成小群体，中央密集处可形成软骨样结节.5d左右即可达到90%以上的融合（图1B）.
图1第二代兔MSCs（A）和软骨细胞×
40
大体观察种植后伤口及种植区未见感染和种植物排出.第8周时，A，B组的种植区触之有片状硬块，取出标本见其外包裹一层结缔组织，剥去结缔组织后标本大小与植入前相当，呈瓷白色软骨样结构，弹性感明显，但钳夹易碎.C组种植区取出为一纤维结缔组织团块，未见软骨样结构.
组织学观察HE染色见A组（图2A）及B组的组织学特征较接近，软骨细胞大部分成熟,包埋在陷窝内,PGA纤维已消失,炎细胞浸润不明显；
C组以纤维组织为主.Masson三色见A组及B组胶原深染,并可见软骨陷窝；
C组则着色极浅.
3讨论
有研究［5］表明，MSCs与生物材料复合后置入动物关节缺损处后可完全修复关节软骨缺损.而将MSCs注入到动物皮下则形成纤维组织.这提示软骨微环境对MSCs向软骨分化及形成软骨组织具有重要意义.目前，自体软骨细胞移植修复软骨缺损的最大问题是难以取得大量自体软骨细胞，而自体MSCs作为组织工程种子细胞具有易获得且可在体外大规模扩增.因此，我们探讨以少量的软骨细胞作为诱导因素，在体内诱导MSCs成软骨分化并构建组织工程化软骨的可行性，以减少构建组织工程化软骨过程中软骨细胞的用量，同时也为组织工程化软骨的构建提供一种简单易行的方法.
A:
混合细胞;
B:
软骨细胞.
图2细胞PGA复合物种植8wk时的组织学观察HE×
100
混合细胞；
图3细胞PGA复合物种植8wk时的组织学观察Masson×
实验结果表明，共培养组与同浓度软骨细胞组在8wk时均形成了成熟的软骨样组织，且都能基本保持原复合物的大小和形状，并具有一定的弹韧性.组织学显示有大量成熟的软骨陷窝形成.这说明在体内共培养过程中少量软骨细胞（25%）已将大量的MSCs（75%）诱导成为软骨细胞并形成了软骨组织.说明在少量软骨细胞的诱导作用下，MSCs可以用来替代大部分软骨细胞而同样构建出成熟软骨组织，这大大节省了软骨构建过程中软骨细胞的用量，且不必应用任何生长因子.
研究［6］表明，MSCs在转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1等因子的诱导下可向软骨细胞分化.软骨细胞能够分泌多种生长因子，其中包括前述的各种生长因子［7-8］.这为我们应用软骨细胞诱导MSCs向软骨分化并形成软骨提供了依据.软骨细胞与MSCs密切接触，则可能通过细胞间的信号传导及软骨细胞合成并分泌的软骨特异性细胞外基质引起MSCs向软骨分化.软骨微环境对MSCs成软骨分化及软骨形成具有重要作用，少量的软骨细胞即可提供软骨微环境，诱导大量的MSCs向软骨细胞分化并在体内形成成熟的软骨组织，减少了软骨构建过程中软骨细胞的用量，从而解决了自体软骨细胞移植修复软骨缺损中大量自体软骨细胞难以获得的问题.
【参考文献】
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