RAGE与肺动脉高压Word格式文档下载.docx

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最近调查已经表明了信号转导与转录激活因子（STAT3）/骨形成蛋白2型受体（BMPR2）/过氧化酶增殖因子活化受体（PPARy）/在肺动脉高压中的影响。

STAT3激活导致BMPR2下调，并减少PPARy，这有助于在PAH中出现细胞增殖及抑制细胞凋亡。

在软骨细胞中，这条轴的激活已经被证实其归功于RAGE，由于RAGE在PAH的病人中是最好的上调蛋白之一并且具有强大的STAT3催化剂，因此，我们假定这是通过激活STAT3，RAGE诱导BMPR2和PPARy的下调，促进肺动脉高压-肺动脉血管平滑肌（PAH-PASMC）的增殖和抑制其凋亡而实现。

方法与结果实验组在试管内，分别取PAH病人和健康人的PASMc，我们观察的到RAGE在PAH-PASMC过度表达（增高6倍），包括STAT3的激活（阳性细胞从10%增加到40%）和BMPR2与PPARy水平的降低（减少超过50%）。

在体内建立PAH模型（用S100A4recapitulates）：

通过控制细胞内的RAGE药理活性（即增加RAGE到6倍，包括激活STAT3并减低BMPR3和PPARy。

）在以上两种情形下，这种表型的功能都因RAGE的抑制而被翻转。

在试管内，通过抑制在野百合碱（MCT）和Sugen诱导的PAH的RAGE后，观察到以肺动脉压和右心室肥厚减轻为特点的效应。

（对照组大鼠平均动脉压设置在15mmhg作用，PAH模型组设置在平均动脉压超过40mmhg,然后将RAGE抑制，结果用MCT和Sugen处理后的两种模型大的大鼠平均动脉压分别降低至20和28mmhg）。

这与改善肺灌注压和血管重建导致的细胞增殖受抑制（抑制超过50%）和BMPR2/PPARy轴的恢复有密切联系。

结论：

我们证实了RAGE在PAH形成过程中的作用。

由此，提出RAGE构成了一种治疗PAH新的，具有应用前景的作用靶点。

结果1：

晚期糖基化终末产物受体（RAGE）增加并激活了在体肺动脉高压（PAH）A,RAGEexpressionmeasuredbyquantitativereverse-transcriptionpolymerasechainreaction（qRT-PCR）normalizedto18Sissignificantlyincreasedinbothwholelungtissue（n=8patientspergroup）andinPAsmooth-musclecells（PASMCs）isolatedfromPAHpatientscomparedwithcontrols.Thiswasconfirmedbyimmunoblotsshowinga6-foldincreaseinPAH-PASMCscomparedwithcontrols（n=3PAHandn=5controlcelllines,P0.01）.通过逆转录聚合酶链反应的定量检测，RAGE在肺动脉高压（PAH）患者的在体的整个肺组织和离体的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的表达均增高。

RAGE的表达与PAH严重程度的关系:

通过免疫荧光测定，RAGE蛋白在终末肺动脉平滑肌细胞中的表达与PAH患者的严重程度呈密切的相关性。

注：

DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种能够与DNA强力结合的荧光材料。

除了肺部以外，RAGE在其他器官及组织没有明显增高。

图2：

RAGE的表达可以被改变A,ControlPASMCstreatedwithS100A4hadasignificantincreaseinRAGEexpressionmeasuredbyimmunoblot（n=3to5celllinespergroup,P0.05）.ItisalsoshownthatscrambledsiRNA（negativecontrol,siSCRM）transfectionhadnoadditionaleffectonPAH-PASMCs.通过免疫印迹法定量检测我们发现：

对照组中加入了S100A4蛋白之后RAGE的表达明显上升，与PAH患者的肺动脉平滑肌细胞内RAGE表达相当，而在此基础上加入了siRAGE之后RAGE的表达显著下降，同时也发发现在转染了干扰siRNA（siSCRM）之后的PAH-PASMCs其RAGE的表达没有明显变化。

而加入了siRAGE之后RAGE的表达显著下降。

B,ThisincreaseinRAGEexpressionandactivationcorrelateswithSTAT3activationmeasuredintheexactsameconditionsbynucleartranslocationassay（percentageofcellswithPY705-STAT3nuclearlocalization）andimmunoblot（PY705-STAT3/STAT3rationormalizedtoamidoblack）（n_50cells/patientin3to5patients,P0.05）.在相同的条件下通过核易位检测与免疫印迹法检测我们发现这种RAGE表达和激活的增加与STAT3蛋白的活化相关在人体PASMC中RAGE能促进STAT3的活化。

图3：

我们已经知道，BMPR2和PPARc是PAH的致病因子。

研究表明，RAGE是这些致病因子的上游致病因子。

A,BMPR2mRNAandproteinexpressionlevelsweremeasuredinS100A-treatedcellsandinPAH-PASMCswithandwithoutsiRAGE.WedemonstratedthatBMPR2ismodulatedwithRAGEexpression,asitwasdecreasedinS100A4-treated（100ng/mLfor48hours）andPAHcellsandwasrestoredonRAGEinhibitioninbothgroupswithbothtechniques（n=3to5celllinespergroup,P0.05）.S100A4处理后的细胞与PAH-PASMCs分别加入和不加siRAGE处理，可以观察到，BMPR2的变化与RAGE的表达密切相关，与对照组相比。

经上述处理后的两组实验，MPR2的表达明显降低，而在加入RAGE抑制剂之后，两组实验MPR2的表达量恢复从前。

B,EffectonPPARcexpressionwasmeasuredbyimmunofluorescence（percentageofcellsexpressingPPARcoftotalnumberofcellsmeasuredbyDAPI;

n_50cells/patientin3to5patients,P0.05）.TheseresultswereconfirmedbythePPARcluciferaseassay（relativeluminescenceunits;

n=3to5celllinespergroup,P0.05）.Furthermore,wedemonstratedthatBMPR2isupstreamofPPARc,asitsinhibition（bysiBMPR2）decreasedPPARcactivity.InbothstimulatedcontrolcellsandinPAH-PASMCs,RAGEinhibitionincreasedPPARcactivity.用免疫印迹法测定PPARc的表达，用荧光素酶定量检测PPARc的表达。

结果表明:

BMPR2在PPARc的上游表达，即它被抑制将减少PPARc的活化。

在对照组与实验组中，RAGE的抑制都使PPARc的活化增多。

为了探究RAGE对在试管内PASMC的增殖与凋亡的作用，我们设计如下实验：

图4：

RAGE对PASMC的增殖与凋亡均有调节作用。

S100A4-treatedcellshadincreasedproliferationrates（percentageofKi67-positivecells;

*P0.001vscontrolcells）.ThiswasreversedonRAGE（siRAGE）orSTAT3（siSTAT3）inhibitionorPPARcactivation（rosiglitazone;

dP0.05vsS100A4）.DecreaseinBMPR2（siBMPR2）orPPARc（W9662）showedincreasedproliferationlevels,likewhatwasfoundwithS100A4（*P0.01vscontrolcells）.Right,PAH-PASMCshadincreasedproliferation,whichwasreversedonRAGE（siRAGE）orSTAT3（siSTAT3）inhibition（dP0.05vsPAH+siSCRM）orPPARcactivation[rosiglitazone];

*P0.01vsPAH）.ThebeneficialeffectofRAGEinhibitionwasbypassedwithBMPR2（siBMPR2）orPPARc（W9662）dowregulation（#P0.05vsPAH+siRAGE）,demonstratingthattheyaredownstreamofRAGE（n_50cells/patientin3to5patients,P0.05）.由图可知：

左图S100A4处理过的细胞促进增殖，该作用可以被RAGE或STAT3抑制作用或PPARc的激活所翻转；

而降低MBPR2或PPARc则可以促进细胞的增殖。

右图中，PAH-PASM细胞增殖作用可以被RAGE或STAT3的抑制剂或PPARc活化剂所翻转。

RAGE抑制剂的效应与BMPR2或PPARy的下调作用相当，由此表明：

后两种者在RAGE的下游。

B,S100A4-treatedandPAHPASMCshaddecreasedapoptosis（percentageofterminaldeoxynucleotidyltransferase-med