细胞实验基本操作与实验室要求PPT格式课件下载.ppt

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二、实验室仪器设备

（一）必要器皿11、培培养养器器皿皿（动动物物细细胞胞培培养养一一般般为为塑塑料料器器皿皿，优优点点是是一一次次性性使使用用，已已消消毒毒灭灭菌菌密密封封包包装装，打打开开即即可可用；

植物细胞培养一般用三角瓶）用；

植物细胞培养一般用三角瓶）22、盛装器皿（各种玻璃器皿）、盛装器皿（各种玻璃器皿）33、计量器皿（量筒、吸管、加样器等）、计量器皿（量筒、吸管、加样器等）44、金属器皿（用于解剖、取材、剪切组织等）、金属器皿（用于解剖、取材、剪切组织等）

（二）常用仪器设备11无菌操作仪器设备无菌操作仪器设备医医用用超超净净工工作作台台（气气流流水水平平型型和和垂垂直直型型），高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌锅锅（手手提提式式、立立式式），干干热热灭灭菌菌烘烘箱箱，过过滤滤除菌装置。

除菌装置。

22培养仪器设备培养仪器设备植植物物：

培培养养架架、摇摇床床、振振荡荡式式培培养养机机（100次次/min）、恒温恒湿光照培养箱、暗培养箱等。

恒温恒湿光照培养箱、暗培养箱等。

动物：

恒温培养箱及动物：

恒温培养箱及CO2恒温培养箱。

恒温培养箱。

33药品存贮和配制仪器设备药品存贮和配制仪器设备44观察分析仪器设备观察分析仪器设备显微镜（高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜显微镜（高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜等）及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮等）及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮容器、恒温箱、精密天平等。

容器、恒温箱、精密天平等。

55其它仪器设备，如流式细胞仪，酶标仪等。

其它仪器设备，如流式细胞仪，酶标仪等。

二氧化碳细胞培养箱二氧化碳细胞培养箱MB-IV型型酶酶标标检检测测仪仪第二节第二节实验室的基本操作实验室的基本操作v实验室的基本操作是围绕实验室的基本操作是围绕无菌无菌要求进行的，主要要求进行的，主要包括清洗、消毒灭菌，无菌操作等。

包括清洗、消毒灭菌，无菌操作等。

一、清洗未未用用过过的的玻玻璃璃器器皿皿：

常常有有游游离离碱碱性性物物质质，使使用用前前，先先用用1%1%稀稀盐盐酸酸浸浸泡泡一一夜夜，然然后后用用洗洗衣衣粉粉洗洗涤涤，清清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。

水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。

已已用用过过的的玻玻璃璃器器皿皿：

用用洗洗衣衣粉粉刷刷洗洗，清清水水冲冲洗洗，晾干备用。

晾干备用。

新的塑料器皿：

打开即用。

已用过的塑料器皿已用过的塑料器皿金金属属器器皿皿：

一一般般不不宜宜用用洗洗涤涤液液洗洗涤涤，新新的的用用热热洗洗衣粉水洗净、冲洗后，蒸馏水冲洗擦干即可。

衣粉水洗净、冲洗后，蒸馏水冲洗擦干即可。

细细胞胞培培养养的的玻玻璃璃器器皿皿常常需需用用洗洗液液浸浸泡泡，再再拿拿出出冲冲洗洗，洗液配方如下：

洗液配方如下：

配方成分配方成分弱液弱液次强液次强液强液强液常用配方常用配方重铬酸钾重铬酸钾（g）浓硫酸浓硫酸（ml）蒸馏水蒸馏水（ml）1、KCrO4液要冷却后才能加浓硫酸。

以防暴沸。

液要冷却后才能加浓硫酸。

2、浓硫酸要慢慢倒入、浓硫酸要慢慢倒入KCrO4液中。

液中。

3、洗液要密封保存，以免失效。

、洗液要密封保存，以免失效。

正常洗液黑棕色正常洗液黑棕色蓝绿色（效用变弱）蓝绿色（效用变弱）二、消毒灭菌严严格格的的消消毒毒灭灭菌菌起起着着至至关关重重要要的的作作用用，主主要要物物理理灭灭菌方法有：

菌方法有：

v湿湿热热灭灭菌菌:

高高温温高高压压法法、流流动动蒸蒸汽汽或或沸沸水水121，1.0-1.1Kg/cm2，20-30分钟分钟v干干热热灭灭菌菌：

烤烤箱箱、焚焚烧烧、酒酒精精灯灯,于于150恒恒温温40min,或或120恒恒温温2h，或或160恒恒温温1.5-2h（芽芽孢孢杆杆菌菌）v射射线线照照射射灭灭菌菌：

紫紫外外线线（细细胞胞培培养养室室，超超净净工工作作台台）、电离辐射、电离辐射v过滤灭菌过滤灭菌：

微孔滤膜、玻璃丝滤器：

微孔滤膜、玻璃丝滤器0.22-高温高压灭菌可能出现的问题：

高温高压灭菌可能出现的问题：

lpH值下降值下降0.3-0.5l太高温度灭菌时可能使糖焦化，可能产生毒性，太高温度灭菌时可能使糖焦化，可能产生毒性，对有些培养基应选择合适条件灭菌。

对有些培养基应选择合适条件灭菌。

l灭菌时间过长使盐沉淀，同时使琼脂解聚灭菌时间过长使盐沉淀，同时使琼脂解聚l挥发性物质不能高温灭菌，否则会被破坏挥发性物质不能高温灭菌，否则会被破坏化学消毒灭菌主要有：

化学消毒灭菌主要有：

v熏蒸灭菌熏蒸灭菌药物蒸汽对室内空气进行杀菌。

药物蒸汽对室内空气进行杀菌。

甲醛和高锰酸钾混合后产生大量蒸汽。

醋烧开。

v化学药品灭菌化学药品灭菌7070%-75%-75%酒精，酒精，升汞升汞漂白粉漂白粉新洁尔敏新洁尔敏过氧化氢过氧化氢v抗生素抑菌法抗生素抑菌法青霉素、链霉素、新霉素青霉素、链霉素、新霉素消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度（%）去除难易去除难易消毒时间消毒时间（min）效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545（mg/L）1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好常用消毒剂消毒灭菌效果比较表常用消毒剂消毒灭菌效果比较表三、无菌操作1、无菌操作前的准备工作：

、无菌操作前的准备工作：

l穿好工作服、戴上工作帽和口罩。

穿好工作服、戴上工作帽和口罩。

l将将各各种种操操作作所所用用的的金金属属器器械械浸浸泡泡在在95或或70的的酒酒精精，点燃酒精灯。

点燃酒精灯。

l将将耐耐热热器器皿皿（不不锈锈钢钢小小盘盘）中中加加入入少少量量酒酒精精，将将蘸蘸有有酒酒精精的的金金属属器器械械及及器器械械支支架架放放入入耐耐热热器器皿皿中中灼灼烧烧，待待凉后备用。

凉后备用。

l用用7075的的酒酒精精擦擦拭拭新新培培养养容容器器和和继继代代培培养养容容器器表面，放置超净台上待用。

表面，放置超净台上待用。

l用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。

用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。

22、无菌操作步骤、无菌操作步骤l将将培培养养材材料料灭灭菌菌后后放放入入已已消消毒毒的的培培养养皿皿中中，置置于于超超净净工工作作台台酒酒精精灯灯火火焰焰下下方方，进进行行适适当当切切割割或或其其他他处处理。

理。

l在在酒酒精精灯灯火火焰焰处处将将培培养养瓶瓶盖盖轻轻轻轻打打开开，瓶瓶口口在在火火焰处旋转灼烧。

焰处旋转灼烧。

l将镊子过火，用镊子将培养材料置于培养基上将镊子过火，用镊子将培养材料置于培养基上l将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。

将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。

继代培养用灭菌的器具（镊子或吸管）继代培养用灭菌的器具（镊子或吸管）直接将培养材料放置在新培养基上。

直接将培养材料放置在新培养基上。

第三节培养基及其配制定义定义：

培养基是离体培养组织或细胞：

培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。

环境。

没有任何一种培养基能够适合一切类没有任何一种培养基能够适合一切类型的组织、细胞和器官的培养。

型的组织、细胞和器官的培养。

必要元素在细胞内的主要生理作用必要元素在细胞内的主要生理作用组组成成各各种种化化合合物物，参参与与有有机机体体的的构构造造，成成为为结构物质。

结构物质。

构构成成一一些些特特殊殊的的生生理理活活性性物物质质，参参与与活活跃跃的的生理代谢。

生理代谢。

元元素素间间互互相相协协调调，维维持持离离子子浓浓度度平平衡衡、胶胶体体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。

稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。

调节形态发生和组织器官的建成。

一、植物细胞培养基及其配制完善的植物培养基配方为：

完善的植物培养基配方为：

水分水分无机营养成分无机营养成分有机营养成分有机营养成分生长调节物质生长调节物质琼脂琼脂

（一）培养基成分11、无机元素、无机元素氮氮-各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成成分。

成成分。

钙钙-细胞壁的成分之一细胞壁的成分之一铁、锌、钼铁、锌、钼-某些酶的组成成分某些酶的组成成分v植植物物缺缺乏乏无无机机元元素素可可能能引引起起的的疾疾病病：

植植物物失失绿绿、细细胞分裂停止、细胞分化受阻等。

胞分裂停止、细胞分化受阻等。

v营营养养元元素素过过多多可可以以引引起起植植物物细细胞胞代代谢谢障障碍碍、生生长长抑抑制。

制。

22、有机营养成分、有机营养成分v提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、氮等营养物质，包括：

氮等营养物质，包括：

氨基酸类氨基酸类维生素类维生素类糖类糖类天然有机添加物类天然有机添加物类氨基酸类氨基酸类v常用：

甘氨酸常用：

甘氨酸v有有时时用用：

丝丝氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸、谷谷氨氨酰酰胺胺、天天冬冬酰酰胺胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白等。

水解酪蛋白和水解乳蛋白等。

v用量通常为用量通常为22-3mg/L-3mg/L。

v水水解解酪酪蛋蛋白白CH和和水水解解乳乳蛋蛋白白LH，对对培培养养材材料料的的细细胞胞分分化化有有良良好好的的促促进进作作用用，用用量量为为100100-2-2000mg/L000mg/L维生素类维生素类v维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动的重维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动的重要物质，对生长、分化有很好的促进作用。

要物质，对生长、分化有很好的促进作用。

用量：

0.1-10mg/L常用：

常用：

盐酸硫胺素（维生素盐酸硫胺素（维生素B1）盐酸吡哆醇（维生素盐酸吡哆醇（维生素B6）烟酸（维生素烟酸（维生素B3）叶酸（维生素叶酸（维生素Bc）有时用：

生物素（维生素有时用：

生物素（维生素H）泛酸钙（维生素泛酸钙（维生素B5）抗坏血酸（维生素抗坏血酸（维生素C）糖类糖类v糖类是培养基的主要碳源。

糖类是培养基的主要碳源。

v常常用用碳碳源源是是蔗蔗糖糖，还还有有葡葡萄萄糖糖、果果糖糖、麦麦芽芽糖糖、木糖、甘露糖、山梨糖等。

木糖、甘露糖、山梨糖等。

v适宜的浓度为适宜的浓度为2%2%-5%-5%。

离体双子叶植物根：

以蔗糖为碳源最好。

单子叶植物的根：

以右旋糖（葡萄糖）为碳源最好。

肌肌醇醇在糖类的互相转化中起作用，是培养基中不可缺在糖类的互相转化中起作用，是培养基中不可缺少的有机营养。

少的有机营养。

形成细胞壁的构建物质：

果胶质形成细胞壁的构建物质：

果胶质。

形成植酸形成植酸与与Ca2+、Mg2+结合成植酸钙镁。

结合成植酸钙镁。

形成磷脂，细