免疫学实验报告Word下载.docx
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免疫
实验二：
抽血、放血，分离抗血清
实验三：
ELISA测定抗体效价
一、抗血清制备的原理
用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
二、目的
制备高效价的抗血清
三、实验仪器、材料和试剂
实验仪器：
1mL注射器，酒精棉球，剪刀
材料：
家兔，小鼠
试剂：
3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA）
三、方法和步骤
1、动物编号
左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。
红色表示十位数,用黄色表示个位数。
免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
2、动物抓取及注射按
如下图所示抓取目标动物
家兔为300～600μg/次（400），每次不超过2mL；
小鼠为10～100μg/次（10-20，20~40μg/ml），每次不超过。
小鼠腹腔注射
以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推～，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。
兔子可以分别尝试皮下（脚掌）、皮内、耳静脉、肌肉注射
抽血、放血，分离抗血清
一、采血
小鼠采血
（一）、尾部采血：
需血量少时可用此方法。
将小鼠放在在有开孔的离心管内，显露尾部，将尾端剪去约5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。
（二）、小鼠睚眦采血：
将毛细管折断，使其断口锋利。
采血时，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。
用毛细管的断口，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入无菌离心管中，收集鼠血。
采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。
用本法短期内可重复采血。
小鼠一次可采血—ml，大鼠一次可采—。
家兔的采血
（一）、耳静脉抽血：
将家兔置于兔固定箱内，对家兔进行耳静脉抽血，此法用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决定加强免疫或放血，与耳静脉注射方式相反。
（二）、心脏抽血：
家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重复上述操作继续抽血，直至抽完。
（三）、颈动脉放血：
家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；
开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶。
注意：
看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。
注意不要剪破毛细动脉管！
！
二、抗血清的分离，保存
1、斜置装血液的三角瓶；
2、用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；
3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜；
4、次日：
估计分离的血清量并观察描述血清颜色；
去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为%），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。
酶免疫吸附试验法（ELISA）测定抗体效价
一、ELISA原理
酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，简称ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
ELISA过程包括抗原（抗体）包被在固相载体上，加待测抗体（抗原）,再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）--待测抗体（抗原）--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
二、实验仪器、材料、试剂
仪器：
酶标板，酶标仪、保鲜膜、排枪
牛血清白蛋白（BSA）——抗原，10μg/ml溶液，包被液配制
鼠抗BSA——待测抗体样品，用PBST从1：
1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度
HRP标记羊抗小鼠IgG——二抗（按说明书稀释使用，用PBST稀释。
）
包被缓冲液：
MpH碳酸盐缓冲液（Na2CO3克，NaHCO3克，加水900ml，调pH，再定容至1L）
PBS溶液（NaClg,或，KCl，KH2PO4，蒸馏水定容至1000ml，）
PBST洗涤液：
含%Tween20的M的PBS（pH）
底物溶液：
（3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺）
2MH2SO4（市售浓硫酸为M，根据要配制的2M硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）
三、实验方法和步骤
1.加抗原：
取酶标板，加入100μl/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加）
2.包被抗原：
保鲜膜包好，37℃1h或4℃过夜（抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上）
3.封闭：
甩干后以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次，每孔加入100μl5%（W/V）脱脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）。
保鲜膜包好，37℃，2h后（封闭的目的：
降低背景干扰，避免假阳性），取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体。
以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次
4.加待测血清：
标记各孔，加入相应稀释度的抗体100μl/孔（用PBST稀释，按示意图用单枪加）。
37℃，保鲜膜包好，60min后甩干孔内液体
5.加二抗：
以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次。
各孔加入酶标二抗100μl/孔，37℃，保鲜膜包好，45min后，甩干孔内液体
6.显色：
加入TMB底物溶液50μL/孔，避光显色10min（抽屉中），然后每孔加入50μl的2M硫酸终止反应
7.结果分析
在酶标仪上，于450nm处测各孔OD值。
阴性无色，OD小于；
阳性黄色，3个重复的平均值大于，且为阴性对照OD值的倍。
打开“酶免大师”，登录密码“1234”，设置参数，选“终点法检测”，建微板，点击“read”，等待读取各孔OD值，导出。
经免疫小鼠
1
2
3
4
5
6
未
免
疫
家
兔
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
结论：
由于实验动物免疫效果不好等原因，所得OD值太小，小鼠免疫还可以，初步判断抗原效价为一价。
未免疫家兔的血清测定的OD值很小，说明实验材料没有很大的污染。
穿插实验;
玻片法—血型鉴定
实验材料：
1、Ag：
受检血样（红细胞悬液）
2、Ab：
标准抗A血清、标准抗B血清（单克隆抗体，不同于标准A型血清、B型血清）。
实验方法和步骤：
1、受检抗原（血样）制备：
用酒精棉球消毒手指---待干后用无菌5#针刺消毒部位---取一滴血（大绿豆大小）于盛有生理盐水的离心管中，混匀。
2、加标准诊断血清到受检血样中，血型判定：
取干净6孔白瓷盘一块（两人用），三孔先各加一滴血样---前两孔分别加入一滴抗A、抗B鉴定血清---用两根无菌牙签分别对前两孔进行混合，水平摇动---2min后观察结果。
实验结果分析
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