Trizol法提取RNA实验步骤与原理新手详细注释版Word文档下载推荐.docx

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用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白

抑制剂都不能是RNase完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备

有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般

情况下采用用DEPC（焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂）配制的70%乙醇擦洗取液器

的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free的物品时必须戴手套。

1、料制品的处理

尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有

开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使

用。

处理步骤如下：

1））在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。

注意：

DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制

品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品

的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、璃玻和金属物品

250°

C烘烤3小时以上。

四、从组织中提取总RNA

1）液氮研磨：

组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再

加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转入离

心管进行第2步操作。

（液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨

碎。

终止细胞内外一切生物反应，防止RNA酶的降解反应）

2）匀浆：

组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。

另外，组织体积不能超过

Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。

五、从细胞中提取总RNA

1）培养贴壁细胞：

不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按

10cm2/ml比例加入。

2）悬浮细胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×

106动物、植物或酵母细

胞，或107细菌细胞。

六、操作步骤

1、、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。

注：

此时可放入-70℃

长期保持。

2、12,000rpm离心5min，弃沉淀。

3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。

禁用漩涡

振荡器，以免基因组DNA断裂。

（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。

有机相中主要是酚和蛋白

结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相）

4、4℃12,000g离心15min。

5、吸取上层水相，至另一离心管中。

千万不要吸取中间界面；

若同时提取

DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。

6、按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇（沉淀RNA）混匀，室温放置5-10min。

7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇（沉淀RNA），温和振荡离心管，悬浮

沉淀。

9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。

10、、室温晾干或真空干燥5-10min。

RNA样品不要过于干燥，否则很难溶

解。

11、可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。

H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。

（TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和

RNA。

用于酶切反应不能使用SDS）

12、测O.D值定量RNA浓度。

此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之间；

产率估计：

组织标本：

（ugRNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ugRNA/106

Cell）：

5-15ug。

注：

组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；

组织或细胞用量过多，会引起

DNA对RNA的污染；

高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后

须4℃12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也

须去掉；

热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；

可用手动匀浆器代替，

然后再充分研磨。

组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器

此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎

6.1.2.1肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法

1使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、

肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中；

2组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合

后于4℃，12,000rpm离心15min；

3取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于

4℃，12,000rpm离心15min；

4取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置

20mins，于4℃，12,000rpm离心15min；

5弃上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4℃，12000rpm离心

5min，重复此步骤一次；

6弃上清后，室温干燥5-7mins；

7加入适量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保

存，检测RNA浓度，并电泳检测。

6.1.2.2RNA浓度测定和电泳检测

取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop2000Spectrophptpmeter测定RNA

浓度及A260/A280的相对吸光度，纯净RNA的A260/A280应在1.8-2.2之间。

电泳检测：

1%琼脂糖，1×

ATE缓冲液，90V电泳30min，凝胶成像系统观

察，分析结果。

6.1.2.3肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成

反应按照TaKaRa公司的PrimeScript?

RTreagentKitWithgDNAEraser

（PerfectRealTime）反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。

①（残存的）基因组DNA的除去反应，在PCR管中配置如下缓冲液。

试剂用量

5×

gDNAEraserBuffer2.0μl

gDNAEraser1.0μl

TotalRNAX*ul

RNaseFreedH2Oupto10μl

（gDNA、genomicDNA、基因组DNA：

是指有机体在单倍体状态下的DNA全部

含量，是染色体DNA，与质粒等染色体外DNA区别。

）

X*：

根据检测到的RNA浓度来配置；

混合均匀后，室温放置20-30min

2反转录反应，在PCR管中配置如下缓冲液（20ulsystem），反应液配制在冰上

进行。

为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制

MasterMix，然后再分装到每个反应管中。

试剂

使用量

5×

PrimeScrpit?

Buffer2fo（rReal

4.0ul

Time）

PrimeScript?

RTEnzymeMixI

1.0μl

RTPrimerMix

①的反应液

10.0ul

upto20

RNaseFreedH2O

3混合均匀后，在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：

85℃

37℃15min

5sec

然后将得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。