版高考生物大一轮复习第十二单元现代生物科技专题第42讲基因工程及其安全性学案Word格式.docx

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（7）优点：

克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。

2．DNA重组技术的基本工具

（1）限制性核酸内切酶（简称：

限制酶）

①来源：

主要是从原核生物中分离纯化出来的。

②作用：

识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

③结果：

产生黏性末端或平末端。

（2）DNA连接酶

项目

E·

coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

功能

连接黏性末端

连接黏性末端和平末端

结果

恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

（3）载体

①常用载体：

质粒

②其他载体：

λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

③具备的条件

a．能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。

b．有一个至多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。

c．具有特殊的标记基因，以便进行筛选。

④作用

a．作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。

b．利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

1．限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）识别序列的特点：

呈现碱基互补对称。

无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；

以为轴，两侧碱基互补对称。

（2）切割后末端的种类

（3）限制酶的选择技巧

①根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类

a．应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

b．不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

c．为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。

②根据质粒的特点确定限制酶的种类

a．所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。

b．质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；

如果所选酶的切割位点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

2．限制酶和DNA连接酶的关系

（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。

（2）限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

（3）DNA连接酶起作用时，不需要模板。

3．载体上标记基因的标记原理

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。

目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。

当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：

关于基因工程工具的几个易错点

（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。

（2）限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。

（3）在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。

（4）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。

（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

（6）基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。

基因工程的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；

膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

（7）基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。

1．（2016·

高考全国卷乙，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。

有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。

结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。

被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

回答下列问题：

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有__________________________________（答出两点即可），

而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是

________________________________________________________________________

____________________________；

并且______________和______________________的细胞也是不能区分的，其原因是

________________________________________________________________________。

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。

（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自____________。

解析：

（1）作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，且含有特殊的标记基因。

（2）未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。

含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分二者。

根据题图，用BamHⅠ切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

（3）噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其DNA复制所需原料来自受体细胞。

答案：

（1）能自我复制、具有标记基因　

（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　（3）受体细胞

2．（2016·

高考全国卷丙，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是________________________________________。

（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。

这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是

______________________________________________________________________。

（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________________和____________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。

（1）由图（a）可知，尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图（b）中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。

（2）运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。

（3）常见的DNA连接酶是E·

coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·

coliDNA连接酶只能连接黏性末端。

答案

（1）Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端

（2）甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录

（3）E·

coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶

　基因工程的基本操作程序

1．目的基因的获取

（1）目的基因：

主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。

（2）方法

2．基因表达载体的构建——基因工程的核心

（1）目的：

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）基因表达载体的组成

（3）构建过程

3．将目的基因导入受体细胞

（1）植物：

农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。

（2）动物：

显微注射技术。

（3）微生物：

感受态细胞法。

4．目的基因的检测与鉴定

（1）利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。

（2）利用分子杂交技术检测目的基因的转录。

（3）利用抗原—抗体杂交检测目的基因的翻译。

（4）利用个体生物学水平的检测鉴定重组性状的表达。

1．基因组文库与部分基因文库

基因文

库类型

基因组文库

部分基因文库

（cDNA文库）

构建基

因文库

的过程

某种生物全部DNA

↓限制酶

许多DNA片段

与载体↓连接导入

受体菌群体

某种生物发育的某个

时期的mRNA

↓反转录

cDNA

2.PCR技术

（1）原理：

DNA复制。

（2）需要条件：

模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。

（3）过程：

DNA受热变性解旋为单链、冷却后引物与单链相应互补序列结合，然后在热稳定的DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。

生物

种类

植物

动物

微生物

常用

方法

农杆菌转化法

显微注射技术

感受态细胞法

主要

受体

细胞

体细胞

受精卵

原核细胞

转化

过程

将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物

Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

4.目的基因检测与鉴定的“四个层面”