免疫组化方法中关键环节及其原理解述.docx

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免疫组化方法中关键环节及其原理解述

免疫组化方法中关键环节与其原理解述

一、酶免疫组化的关键环节

1、标本固定：

固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。

2、脱水、石蜡包埋和制片：

脱水用梯度乙醇〔由低到高〕充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。

否如此，容易裂片和脱片等。

3、脱蜡和水化：

这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反响。

脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。

水化用梯度乙醇〔由高到低〕。

假如脱蜡和水化不全易出现局灶性反响和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4、抗原修复：

由于组织中局部抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联与醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。

常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。

修复液也分为假如干种〔具体的可以查阅相关资料，大量的：

中性的、高pH的等〕。

我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。

注意微波修复后自然冷却30min左右〔只要你觉得修复液的温度达室温即可〕。

5、细胞通透：

目的是使抗体能够充分地进入胞进展结合反响。

一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。

如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体与大分子结构的物质进入胞浆和胞核，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞与相应抗原结合。

在免疫组织化学〔>10um厚切片〕和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。

6、灭活源性过氧化物酶和生物素：

在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反响结果容易收到源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进展灭活。

灭活源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。

3%过氧化氢如此可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。

不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒〞防止源性生物素的干扰，推荐使用。

7、血清封闭：

组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反响的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

一般室温或37度10-30min。

8、一抗和二抗浓度和孵育时间：

一抗孵育条件在免疫组化反响中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。

一抗孵育温度有几种：

4度、室温、37度，其中4度效果最优；孵育时间：

这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

具体条件还要摸索。

二抗孵育条件：

二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，假如是浓缩液还要摸索浓度。

但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

9、抗体稀释液：

其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的屡次回收利用较好。

正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果〔提示可能一抗没有结合〕，最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反响不佳，终而出现假阴性结果。

10、切片清洗〔浸洗、冲洗和漂洗〕：

为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗〔延长时间和增屡次数〕尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意：

〔1〕单独冲洗，防止交叉反响造成污染。

〔2〕温柔冲洗，防止切片的脱落。

我喜欢用浸洗方式；〔3〕冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

〔4〕PBS的PH和离子强度的使用和要求。

这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄〔未见特.6浓度是0.01M。

〔中性与弱硷性条件〔PH7-8〕有利于免疫复合物的形成，而酸性条件如此有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度如此有利于分解〕

11、DAB显色：

背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。

DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短〔如几秒或几十秒〕就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，假如很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长〔如超过十几分钟〕才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短〔最好一抗4度过夜〕；另一方面就是封闭时间过长。

12、复染：

目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进展定位，经常用苏木素复染〔胞核染料〕。

注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白如此要短。

不过这个如果染色不理想可以补救的。

即：

染色深如此分化时间稍长些即可；染色浅如此再置于苏木素中染色即可。

盐酸酒精是分化，氨水是返兰。

作用不同。

片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒〔一定动作要快〕后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

13、封片：

为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，防止产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，如此可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

二、免疫荧光方法中的重要环节

1、冰冻切片制备：

建议用新鲜组织，否如此组织细胞部结构破坏，易使抗原弥散。

选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定：

切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进展固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要与时固定和适当保存。

3、血清封闭：

为防止源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清〔与二抗来源一致〕封闭，减弱背景着色。

血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。

4、一抗孵育条件：

在免疫组化反响中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。

一抗孵育温度有几种：

4度、室温、37度，其中4度效果最优；孵育时间：

这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件：

二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，假如是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反响。

但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进展适当的离心。

6、复染：

目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进展定位。

一般常用DAPI复染。

7、封片：

为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。

防止产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，如此可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗：

为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗〔延长时间和增屡次数〕尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意〔1〕单独冲洗，防止交叉反响造成污染。

〔2〕温柔冲洗，防止切片的脱落。

我喜欢用浸洗方式；〔3〕冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

〔4〕PBS的PH和离子强度的使用和要求。

这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄〔未见特异性染色〕，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。

〔中性与弱硷性条件〔PH7-8〕有利于免疫复合物的形成，而酸性条件如此有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度如此有利于分解〕

9、拍照：

有条件的话最好立即拍照，假如不能与时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。

使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进展操作，不要随意改变程序；应在暗室中进展检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。

天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。

灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。

一天中应防止数次点燃光源。

关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。

假如将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否如此电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析与其对策

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的根底和前提。

由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。

需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。

虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：

无色片〔即无阳性信号〕和“杂音〞染色片〔有阳性信号〕。

一、无色片

染色完毕后，切片中见不到任何阳性信号。

这是常规工作中比拟常见的现象，出现这种现象，有两种可能：

1、真阴性结果：

整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。

2、假阴性结果：

即此阴性结果不是真实的反映。

假阴性结果又可分为两种情况：

〔1〕切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。

出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。

获得正确的切片进展染色是获得正确结果的前提。

由此明确：

制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。

〔2〕染色过程中的某一或某些环节出了问题。

比如，组织未进展抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。

也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

为了防止这种简单的错误，有一种简单的方法：

在三抗孵育完毕时，将切片上的三抗甩在一白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。

如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。

如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。

如果纸上不出现棕色反响，问题肯定在三抗或DAB的配制过程。

这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。

解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照〞。

如果阳性对照有