青霉素发酵效价的生物学测定_精品文档文档格式.doc
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天然青霉素系从青霉菌的培养液中提取获得，主要含有：
青霉素F、G、X、K和双氢F五种。
其中以青霉素G（又名苄青霉素）的作用最强，性质较稳定，产量亦较高
青霉素作用机理:
使细菌细胞壁缺损（黏肽），菌体内的高渗透压使细胞外面的水分不断地渗入菌体内，引起菌体膨胀变形，加上激活自溶酶，使细菌裂解而死亡.G+
（二）青霉素效价的生物学测定的原理
1.效价:
是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度
微生物鉴定法：
以抗生素对微生物的杀伤力或抑制
程度为指标来衡量抗生素效价的方法
理化方法：
根据抗生素的结构特点，利用其特有的化
学或物理性质及反应而进行的
抗生素活性表示方法：
抗生素的活性以效价单位来表
示;
每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位u表示
一个青霉素效价单位：
能在50mL肉汤培养基中完全抑制金色葡萄球菌发育的最小青霉素剂量;
以IU表示.
1mg青霉素G钠盐定为1667单位
1mg青霉素G钾盐为1595单位
（三）管碟法测量抗生素效价的方法
1、利用抗生素在培养基内的扩散渗透作用，将已知效价的标准品溶液与未知效价的被检品溶液在同样条件下加入已放置在含有高度敏感性的试验菌的培养基上的小管内
2、培养后，在抗生素扩散到达的适当范围内，产生了透明的抑菌圈。
不同浓度的抗生素，抑菌圈的大小不同；
比较标准品与检品的抑菌圈大小，利用不同的计算原理，就可以推算出此抗菌素的效价
（四）青霉素摇瓶培养的操作流程
1.菌种活化:
从保藏菌种接种到灭菌的斜面培养基中,25℃培养6-7天;
待斜面上长满菌苔后作为以及菌种制备的起始菌株
2.一级斜面菌种制作:
从起始菌株斜面接种到灭菌的斜面培养基,25℃培养6-7天,如无杂菌污染及为一级斜面菌种
3.摇瓶培养:
从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基,25℃、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定等
4.发酵罐培养:
流程：
冷冻管→斜面母瓶→大米孢子→一级种子罐
→二级种子罐→发酵罐→放罐→至提炼
各步所需培养条件：
1.25℃，6—7天；
2.25℃，6—7天；
3.25℃，40—45h，1：
2VVM（每分钟通气体积比）
4.25℃，13—15h，1：
1.5VVM;
5.22-26℃，6—7天，1：
1—0.8VVM。
三.实验材料
1.菌种
n产黄青霉菌（Pentcilliumchrysogenum）
n金黄色葡萄球菌（Staphylococcusauoreus）
2.药品
n青霉素钠
n0.2mol/LpH6.0磷酸缓冲液
n0.85%生理盐水
n发酵培养基
n生物测定培养基
3.仪器及器皿
四.操作步骤
1.发酵培养基的配制:
按照配方配制液体培养基，250ml三角瓶装液量为100ml。
2.摇瓶培养:
从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基,25℃、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定
3.青霉素标准溶液的配制:
准确称取纯苄青霉素钠0.06g,溶解在pH6.0的磷酸缓冲液,配成100ml1000单位/ml的青霉素标准工作液.按下表加入青霉素标准溶液
1000/1667mg=0.6mg1000单位
100ml1000单位/ml100*0.6mg=0.06g
称取0.06g苄青霉素钠溶于100ml的磷酸缓冲液
不同浓度青霉素标品溶液的配制
试管号
青霉素浓度（单位/ml）
1000单位/ml青霉素溶液（ml）
pH6.0磷酸缓冲液（ml）
1
100
9
2
200
8
3
300
7
4
400
6
5
500
4.金黄色葡萄球菌菌悬液的制备
n将37℃培养16-18h的斜面菌种,用0.85%的生理盐水洗下,离心沉淀（3000rpm*5min）,倾去上清液,沉淀菌体再用生理盐水离心洗涤1-2次
n再将其稀释至一定浓度（约109个/ml，或用分光光度计在波长650nm测透光率为20%左右即可）。
5、生测平板的制备
n配制生测培养基500ml，灭菌后冷却至50℃，每10ml加入适当稀释的金黄色葡萄球菌0.3ml（15ml），充分混匀；
在超净台中倒平板
n注意：
实验中加菌体的量要控制在使10单位/ml青霉素溶液的抑菌圈直径在20～24mm之间。
6.青霉素标准曲线的绘制
n生测培养基平板完全凝固后，在每个琼脂平板上轻轻放置牛津杯2个，小杯之间的距离要均匀。
然后用移液枪加入不同浓度的青霉素标准溶液，200ul/牛津杯。
每个青霉素浓度做3个平行平皿
n加入标准青霉素溶液后，将平皿移至37℃培养箱中培养18～24h，移去牛津杯。
精确测定抑菌圈的直径大小
不同浓度青霉素标品的抑菌圈直径
在坐标纸上,以青霉素浓度为纵坐标,以抑菌圈直径的校正值为横坐标，绘制标准曲线.
7.青霉素发酵液效价的测定
n根据发酵时间用1%pH6.0的磷酸缓冲液将发酵液适当稀释.每个被测样品用3套平皿进行测定.青霉素标准液（1单位/ml）与待测样品的稀释液间隔的加入小管内.37℃培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小
8.青霉素效价的计算:
n将青霉素标准液（10单位/ml）的抑菌圈直径进行校正,取得校正值;
将此校正值校正待测样品的抑菌圈直径;
在标准曲线上根据校正后的抑菌圈直径查得待测稀释液的青霉素效价;
根据稀释度得到发酵液的青霉素效价
五.实验内容
1.青霉素标准溶液效价的测定及曲线绘制
六.结果分析
青霉素浓度（U/ml）
600
抑菌圈直径（mm）
11.4
16.3
19.6
21.1
21.4
17.00=0.0248x+10.52
X=261.3U/ml
由实验R2=0.8765，结果不是很好，但基本上符合要求。
可能的原因有：
1、制备平板是菌悬液与培养基混合不充分导致其无法充分生长；
2、菌的接种量有限，菌数已经达到最大值；
；
3、青霉素加液是不准而影响测量结果。
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