酶联免疫吸附测定法_精品文档Word文档格式.docx
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4.4 包被的条件：
4.5 洗涤液：
4.7 酶的催化性；
10
4.8 结合物的制备 10
4.9 结合物的保存 11
4.10 酶的底物 11
4.11 酶反应终止液 11
4.12 参考标准品 12
4.13 加样：
12
4.14 保温 12
4.15 保温方式：
4.16 室温温育的反应 12
4.17 洗涤 13
4.18 显色 13
4.19 比色 13
4.20 酶标比色仪 14
4.21 结果判定 14
4.22 定量测定 15
4.23 ELISA的操作要点 15
1.定义
酶联免疫吸附测定法（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理
采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应
2.1.1可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·
Ab
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：
K=[Ag·
Ab]／[Ag][Ab]，Ag·
Ab的解离程度与K值有关。
高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。
2.1.2特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。
2.1.3最适比例
只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。
以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）
图
（1）
该理论的支持者网格学说，其成立的三个条件：
Ø
抗原多价，抗体双价；
二则比例合适；
Ag/Ab过剩。
当抗原抗体浓度比例合适时，抗体的两个Fab段分别结合两个Ag分子，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，沉淀可见，如图b。
Ab/Ag过剩时，过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物，沉淀不可见，如图a，c，d。
图
（2）
2.1.4敏感性
化学比色法的敏感度为mg/mL水平；
酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/mL；
免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应相仿；
标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mL水平。
如HBsAg，其敏感度可达0.1ng/mL。
2.2免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可测试标本中的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
3.ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：
免疫吸附剂：
固相的抗原或抗体；
结合物：
酶标记的抗原或抗体；
底物：
酶催化的此物。
常见的检测方法有：
双抗体夹心测抗原、
3.1双抗体夹心法测抗原：
图（3）
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可以用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
3.2双抗原夹心法测抗体
用特异性抗原进行包被和制备酶标结合物。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
3.3间接法测抗体
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
3.4竞争法测抗体
图（4）
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
3.5竞争性测抗原
小分子抗原或半抗原缺乏可作为夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。
标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，最后显色也越浅。
小分子激素、药物等多用此法。
3.6捕获包被法测抗体
以IgM抗体为例。
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和非特异性IgM，以及特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM的测定。
捕获法则较好地解决了上述问题，其原理是先用抗人IgM（μ链）抗体包被固相载体，使血清中所有IgM（包括特异性与非特异性IgM）均固定在固相上，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。
此方法目前主要用于检测各类早期感染的特异性抗体IgM。
3.7ABS-ELISA法
ABS为亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）的略语。
亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。
生物素为小分子化合物，分子量244。
用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。
生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。
由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。
两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。
在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。
在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。
从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。
由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。
4.ELISA试剂的组成
ELISA试剂中有三个必要的组成部分：
免疫吸附、结合物、酶的底物。
常见的组成如下：
已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
酶标记的抗原或抗体（结合物）；
酶的底物；
阴性对照品或阳性对照品，参考标准品；
结合物及标本的稀释液；
洗涤液；
酶反应终止液；
4.1固相载体：
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍能保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯，对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一条各孔之间性能相近。
4.2包被的方式
将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。
这种物理吸附是非常特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
不易吸附的非蛋白质抗原，可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。
亲和素生物素，即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质，无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。
优点：
试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性也好，抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至1/100。
4.3包被用抗原：
合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
一般只含有一个抗原决定簇，纯度高、特异性也高。
但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。
借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
包被用抗体：
IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联接发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。
取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。
腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。
在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
4.4包被的条件：
Ph9.6碳酸盐缓冲液；
pH7.2磷酸盐缓冲液；
Ph7-8Tris-HCl缓冲液；
加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。
包被浓度随载体和包被物的性质可能有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。
一般蛋白质的包被浓度为10ng/mL-20ug/mL。
封闭：
在包被后，用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
封闭让大量无关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后步骤中干扰物质的再吸附。
常用的封闭剂：
0.05%-0.5%BSA；
10%的小牛血清或1%明胶；
脱脂奶粉，比较价廉，可以用高浓度（5%）。
4.5洗涤液：
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。
4.6结合物：
即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂。
4.7酶的催化性；
抗体（抗原）的免疫活性；
含有或少含有游离的抗体（或抗原）；
结合物要有良好的稳定性。
结合物用的抗原和抗体
制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他蛋白的干扰。
最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本地浅淡。
在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。
酶
纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。
酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。
在ELISA中有HRP,AP,葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。
4.8结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
戊二醛交联法：
戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基酸通过它而联结。
有效（结合率达60%-70%）和重复性好。
但是交联反应是随机的，结合物的大小不一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。
过碘酸氧化法：
适用含糖量较高的酶。
过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏而结合。
简单有效。
结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶的活性测定，但会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。
制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定
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