环境水样品中大肠杆菌及粪耐热大肠杆菌的检测_精品文档Word文档下载推荐.doc
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当水体被粪便污染时，其含量较高，由此判断水质高低。
【材料与方法】：
（一）材料
乳糖蛋白胨培养液：
蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸馏水1000ml（10ml/试管+小倒管20支）
EC肉汤培养基：
胰蛋白胨20g、3号胆盐1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g 、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml（10ml/试管+小倒管10支）
伊红美蓝培养基：
蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20~30g、2%伊红水溶液20ml、0.5%美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml（150ml/瓶）
4.5mL无菌水：
4支
（二）器材
无菌1mL移液管：
4支；
40~200微升移液器、吸气器：
各1支；
200微升无菌Tip：
20只；
载玻片和盖玻片若干；
革兰氏染色各试剂；
培养皿若干套；
酒精灯；
显微镜等
（二）原理及方法
1、样品的稀释和培养：
取原环境水样0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-1样品；
再从10-1样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-2样品；
再从10-2样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-3样品，再从10-3样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-4样品，每个稀释度两管。
再从10-1、10-2、10-3和10-4样品中各取1ml到乳糖蛋白胨培养基中（每个稀释度样品各5支试管）
2、初发酵实验：
原理：
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。
溴甲还有抑制其他细菌如芽孢杆菌的生长的作用。
方法：
（1）将上述15支试管放入37℃中培养24h；
（2）取出试管观察，若发现试管由紫色变成了黄色，即证明产酸；
若发现小倒管中有气泡产生，即证明产气；
（3）记录各试管的产酸产气的情况，将阳性反应（产酸产气）的试管中的样品取一滴（50μ）L转接于EC培养基上，并做好标记。
注：
在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。
48h培养后仍不产酸产气的为阴性反应。
3、45℃培养鉴定：
原理：
37℃下培养产生阳性反应的试管样品不一定是全部都是粪大肠杆菌，经过45℃下培养，若还能产生阳性反应的即可能为粪大肠杆菌（耐热性较好）
方法：
（1）将上一步接种的EC培养基的试管置于45℃下培养24h；
（2）取出试管观察，记录发生阳性反应的试管（产酸并产气）
4、平板分离：
原理：
伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落。
方法：
（1）将37℃培养管（48h）和45℃培养中的发生阳性反应的试管中的菌接种于伊红美蓝培养平板，分别再于37℃和45℃的条件下培养过夜。
（2）培养过夜后取出平板，挑选深紫色、具金属光泽，紫黑色、不带或略带金属光泽，淡紫红色中心颜色较深的菌落。
5、革兰氏染色：
原理：
大肠杆菌为革兰氏染色阴性菌，经过革兰氏染色后在显微镜下显示为红色杆状（有的能观察到芽胞）。
挑选伊红美蓝培养阳性的菌落，进行革兰氏染色，镜检为红色且无芽胞即为大肠杆菌群。
6、查阅MPN表，得出全部大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最可能数。
【结果与讨论】
1.实验结果记录
1.137℃培养24小时后，10-1、10-2和10-3均产酸产气，为阳性结果；
10-4中只有C管产酸产气，其余四管不产酸不产气。
现象
试管号
产酸
产气
10-1
A
+
+
B
C
D
E
10-2
+
10-3
10-4
—
—
—
C
“+”为有此现象，“—”为无此现象。
37℃10-1稀释度
37℃10-2稀释度
37℃10-3稀释度
37℃10-4稀释度
1.2阳性管中样品接种于EC培养基（16管），45℃培养24小时后，10-1、10-2和10-3的A~E管均产浑浊产气，10-4的C管中不产浑浊不产气（A、B、D、E管37℃下为阴性，不接种至45℃）
+
45℃10-1稀释度
45℃10-2稀释度
45℃10-3稀释度
1.337℃和45℃培养过24小时后的阳性和假阳性管中的菌于伊红美兰平板培养，镜检结果及革兰氏染色结果如下：
温度
37℃
45℃
菌落颜色
菌体形
状
革兰氏染色
菌体形状
A
白，外区紫并有金属光泽
杆状
阴性
深紫，金属光泽
短杆状
B
D
E
紫，无明显金属光泽
无菌落
少量透明菌落
少量透明菌落（略带紫）
伊红美蓝实验37℃
伊红美蓝实验45℃
革兰氏染色结果，依次为阳对，阴对，样品代表
1.4查MPN表结果
45℃时，10-1、10-2、10-3的阳性管数依次为5,5,5。
通过《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T5750.12-2006）查表可知，环境水样品的总大肠菌群数为＞1600MPN/100ml，即＞160000MPN/L。
2.有关该样品水质的判断
根据《中华人民共和国地表水环境质量标准》（GB3838-2002），该样品水质为ⅴ类（粪大肠菌群（个/L）<
=40000）。
3.结果分析
（1）实验检测结果表明，取样点（水果湖）的水质为Ⅴ类，属于较差级别类。
我们根据取样点的图片（如下）分析，该处河流浑浊，显棕绿色，且河水流速小，周围植被覆盖少，附近可能有下水道排污口，因此水中大肠杆菌的含量较多。
特别是粪大肠杆菌，能在该环境下进行大量繁殖，造成水体污染。
（2）本实验中，在37℃前三个稀释度的伊红美蓝实验对应的接种区均是白色菌落和紫色金属光泽菌落同时存在，且都不少，而在45℃的三个稀释度的15个接种区里均是深紫带金属光泽。
说明在37℃下还有大肠杆菌之外的别种菌也是优势菌种，而耐热大肠杆菌能耐高温，在45℃下成了唯一的优势菌种，从而白色菌落未出现。
（3）在37℃下显示为阳性的10-4C管在45℃下为阴性，可能的原因有是，那一管中确有大肠杆菌，只是耐热大肠杆菌浓度极低或没有，所以在高温下显示为阴性。
而至于为什么同稀释度其它四管没有此现象，可能是该稀释度的菌液没有混合均匀造成的。
（4）本实验检测的对象为大肠菌群，大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染
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