小分子蛋白电泳技术分享_精品文档Word文档下载推荐.doc
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Acrylamide46.5g
Bis3.0g
Watermakeupto100ml
3.GelBuffer(3MTris/cl,PH8.45,0.3%SDS)
SDS0.3g
Tris36.4g
PHto8.45withHCL
注:
3MTris配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2MTris,配方如下:
Watermakeupto150ml
4.Anode(Lower)buffer阳极缓冲液(0.2MTris/cl,PH8.9)
Tris12.11g
Watermakeupto500ml
PHto8.9withHCL
5.Cathode(Upper)buffer阴极缓冲液(0.1MTris/cl,0.1MTricine,0.1%SDS,PH8.25)
Tris6.06g
Tricine8.96g
SDS0.5g
不用调PH值
6.4×
TricineSDSSamplebuffer4×
上样缓冲液
(Finalconcentration:
0.05MTris/cl,4%SDS,12%glycerol,200mMDTT,0.01%CommasieG250)
8×
Tris.cl/SDSPH6.82ml
Glycerol4.8ml
SDS1.6g
CommasieBlueG2504mg
Watermakeupto10ml
Tris.cl/SDSPH6.8配方
Tris6.05g
SDS0.4g
PHto6.8withHCL
二、胶的配制
1.16.5%T6%Cseparatinggel30ml
49.5%T6%C10ml
Gelbuffer15ml
Glycerol3.2ml
Water1.8ml
2.10%T3%Cspacergel30ml
49.5%T3%C6.1ml
Water8.9ml
3.4%T3%Cstackinggel12.5ml
49.5%T3%C1ml
Gelbuffer4.65ml
Water6.85ml
用Bio-Rad系统,0.75mm的胶,separatinggel配3ml,加2.5ml;
Spacergel配1ml,加0.7ml;
Stackinggel配1.25ml.灌胶前临时加10%AP(过硫酸铵)和TEMED.
胶配制的通用配方:
三、电泳参数及染色脱色
1.用Bio-Radmini电泳装置进行电泳.30V电泳1hr,100V至电泳结束
2.固定,染色及脱色:
小分子量肽类在SDS-PAGE胶中容易扩散,因此电泳结束后,有时需要固定20min(固定液:
0.5%戊二醛,30%乙醇),再进行染色20-30min(染色液:
50%甲醇,10%乙醇,0.2%G-250),在脱色液(45%甲醇,10%冰醋酸)脱色20-30min;
脱色完毕,把胶放在水中或10%甘油中.
四、电泳示例照片
小分子该选择用tricine-SDS-PAGE.
protocol上写着
thecommonroleofglycerolinSDSgelsistoincreasethedensityofsolutionsandto
facilitategelcasting;
ithasnoobiouseffectonproteinseparation
Itried25%Tricinegelfor3KDpeptide,looksgood.GoodLuck!
哦,我自己经常做2x多的分子,用的是15%的gel,效果很好的。
1xKD的用16%的PAGE就应该可以了。
你可以试一试Tricine-SDS-PAGE,16%的分离胶,6%的浓缩胶。
分离胶单体母液:
46.5g丙烯酰胺+3g双叉丙烯酰胺,双蒸水溶解定容到100ml
凝胶浓度49.5%,交联度6%
浓缩胶单体母液:
48g丙烯酰胺+1.5g双叉丙烯酰胺,双蒸水溶解定容到100ml
凝胶浓度49.5%,交联度3%
配方:
分离胶母液3.3ml+凝胶缓冲液3.3ml+30%甘油2.4ml+双蒸水1.0ml+10%AP45μl+TEMED4.5μl
浓缩胶母液0.3ml+凝胶缓冲液0.93ml+双蒸水1.27ml+10%AP25μl+TEMED2.5μl
分离范围1~100KD,最佳分离范围2~70KD
初始电压30,等样品进入分离胶电压升至80,最终电压可升至120
其实12kD的蛋白,15%的也就可以了,20%的也没问题
如果你的表达量不高,跑胶的时候由于电泳路径较长,容易造成弥散和分解,可以把胶跑得短一点,条带挤一点,跑一半分离胶的高度就足够了。