植物内生菌分离处理方法_精品文档Word文档下载推荐.doc
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将根,茎,叶一次用75%酒精浸1min
1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次
置于含双抗的VA培养基平板培养
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离
宋培勇
珙桐茎、叶和叶柄
将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分
别用流水冲洗,风干表面水分,剪成小块或小段,
无菌水漂洗2次
75%酒精浸泡1min
再用2%
NaClO溶液中浸泡3min,转入75%酒精中浸泡30s,
接着用无菌水漂洗3次,
取最后一次漂洗液涂布NA平板作为对照
平放于NA平板上,28°
C培养2−3d
孙传伯2011
台湾7303毛豆全株
采回的样本用自来水洗净,并用无菌纸吸干水分,并用无菌纸吸干水分,切取支根110cm长的小段,须根切成115cm的小块
用75%酒精浸泡5min、7min、10min
分别用0.1%升汞溶液处理4min、6min、8min进行表面灭菌,此试验分别重复3次。
最后用无菌水冲洗4次,。
最后用无菌水冲洗4次
将组织块在研钵中充分研磨成匀浆
最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板,26~28e下培养2~3d,筛选出最佳消毒时间和培养基,将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。
以无菌水冲洗为对照试验。
取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上,取匀浆涂布于不同培养基平板,每浓度重复3次,然后将培养皿置于26~28e恒温箱中培养2~3d,观察培养出的菌落形态
张鑫
植物圣罗勒的健康
叶子
将叶子用流水冲洗10min
1%的次氯酸钠中浸泡10min
0.02mol/L、pH7.0的无菌磷酸钾缓冲液(PB)漂洗
4次
加无菌水将材料研磨
涂布培养
李铭,
石耳目地衣
为了诱导产孢,黑化菌株在光照/黑暗(12h∶12h)条件下,于2%的PDA
培养基上,18℃下培养3个月
刘杰凤
健康的小白菜,染病的小白菜根,茎,叶
流水冲洗干净,剪成小段
75%酒精中浸泡3min
10%次氯酸钠浸泡茎为8min,根和叶由于气孔较茎大,浸泡5min即可,然后用无菌水浸泡多次,每次3min
无菌条件下用适量的
PBS
缓冲液捣碎
以最后一次的漂洗液作对照
,30℃
下培养
一个星期
搅拌后静置3min,取上清液0.5mL分别涂布于分离培养基平板上,每种材料做3次平行
朱士茂
新采集的银杏枝条,叶子和根
在自来水中冲洗干净,然后将枝条和根截成3-4cm长,将叶子和叶柄分开,分别将根,枝,叶放在不同的灭菌后的广口瓶中
(一),根的表面灭菌:
0.1%的土温20消毒1min,无菌蒸馏水冲洗2次。
(二)枝,叶和叶柄:
75%的乙醇消毒30s,无菌蒸馏冲洗3次
(一),根:
75%的乙醇消毒30s,无菌蒸馏水冲洗2次,0.1%升汞消毒5min,无菌蒸馏水冲洗5次。
(二)枝,叶和叶柄:
0.1%升汞消毒7min,无菌蒸馏水冲洗5次
茎,将其表皮剥离,用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分,然后将其切成0.5cm×
0.5cm大小
叶和叶柄,用研钵将叶磨碎(内放石英砂和生理盐水)然后用无菌移液管吸取0.2ml放入培养皿中
①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入5min后用无菌镊子取出;
②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料,然后将此液体移入培养基中,培养观察。
KB培养基:
PL培养基:
PDA培养基:
肖淑贤
2011.
长势好、无病害的植株
在自来水中冲洗干净
采用升汞、乙醇、H2O2、次氯酸钠等表面消毒剂进行消毒,无菌水冲洗
直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释
王剑峰
取生长15天马铃薯
无表面灭菌方法
马铃薯内生菌单菌落的分离取生长15天马铃薯LK99组培苗,剪成长度约1.0cm的带腋芽茎段接种于PSA培养基上,分别于光下(28℃、2200Lx、16hr光/8hr黑暗)或28℃暗培养,3天后光下和黑暗条件下组培苗周围的培养基上出现黄色菌块,挑取黄色菌块,用稀释涂布法[66]分离单菌落。
李晓红
不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较
内容残缺)
熊亚南
刺五加植株流水冲洗去土,根,茎,根茎等部
流水冲洗去土
按根,茎,根茎等部进行分割,每段长10cm左右,按下列程序表面消毒:
无菌水冲洗→95%酒精漂洗1min→6%的Naclo浸3min
75%的乙醇漂洗0.5min→无菌水漂洗3次
进行分割,每段长10cm左右
同样处理的材料不做切割直接滚印于对照平板,并去最后一次漂洗的无菌水平板涂布,置相同条件下培养,无菌长出即为表面消毒彻底。
NA培养基。
将上述处理过的材料韧皮部与木质部无菌分离,韧皮部切成约0.5cm×
0.4cm的薄片,然后将薄片直插入和水平贴附两种方式置于分离平板上,25-28℃暗箱培养,带材料边缘有菌苔长出后转接与纯化平板划线法分离纯化,镜检验纯后转接到斜面。
邓正山
2012
健康的大蒜鳞茎
用纯净水冲洗干净
依次用体积分数75%的乙醇浸泡3min
0.1%的氯化汞表面消毒15s,再用无菌水漂洗5次
杨明琰
新鲜的杜仲
将新鲜植物材料用自来水冲洗外表面直至干净,晾干。
用无菌刀将样品切割成3cm左右的小段
75%的酒精溶液中浸泡6min,用无菌水冲洗样品表面3~5次
再在4%的次氯酸钠溶液中浸泡3min,用无菌水冲洗样品表面3~5次
用镊子及解剖取其韧皮部,切除两端后切成大约1cm×
0.5cm的小段
①漂洗液检验法:
把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于PDA平板上,28℃恒温培养。
②组织印迹法:
将上述表面灭菌处理的完整枝段压入PDA平板内,使表面灭菌材料与培养基接触30min后,移去植物材料,28℃恒温培养。
③组织压入法:
将灭菌材料不经切割直接贴于PDA培养基表面,28℃恒温培养
将小段,贴于PDA培养基的表面,每皿放3块材料,于28℃恒温培养箱内培养5~10d。
待菌丝从植物组织长出后,从边缘挑取菌丝移至另一PDA平板上进行纯化
胡秀荣
采集健康的柑橘植株
放线菌
:
先在自来水下冲洗掉样品表面的泥土,再用超声波清洗
放线菌:
然后用99%乙醇处理1min,3%次氯酸钠处理5min
最后用99%乙醇再处理30s
灭菌好的材料用无菌刀切成1cm×
1cm小块,置于分离培养基表面
将最后一次处理植物样品的清洗液涂在ISP2培
养基上,用以检测表面灭菌的效果
熊党生
取新鲜健康的葛根的根、茎、叶
分别用水冲洗干净,用滤纸吸干水分
无菌水冲洗2遍,先用体积分数75%酒精浸泡3~5min(叶子3min,茎4min,根5min),无菌水冲洗3~4遍
用0.1%升汞浸泡2~4min(叶子2min,茎3min,根4min),无菌水冲洗4~5次
在无菌的条件下,用灭过菌的手术剪刀将植物根、茎、叶剪成小段,从中间剪开后,分别置于含有葛根浸出夜的PDA琼脂培养基上,置于生化培养箱中培养一段时间
将上述经过表面消毒后未作任何处理的材料直接置于平板中,27℃培养,结果材料周围未见任何菌长出,证明所分离的菌株为葛根的内生菌。
挑取内生细菌到牛肉膏蛋白胨培养基中,挑取内生真菌的菌丝到PDA培养基中纯化数次,将纯化好的菌种接种到斜面培养基上保存备用
张彦涛
白蜡、茅草、射干、罗布麻、蓼草、胡杨、怪柳。
取采集的新鲜样品,用蒸馏水将植物表面洗净
干后分别取其根、茎、叶,在75%乙醇消毒液中浸泡3~5min
3%次氯酸钠浸泡5min,75%乙醇浸泡5min。
最后用无菌水冲洗3~4次
将样品在灭菌的研钵中研磨,加适量无菌生理盐水研磨至匀浆状
最后一次冲洗的无菌水涂布平板做空白对照
(分离培养基)取1mL液体分别按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀释,并分别涂布平板,37℃恒温培养2d。
红树林内生放线菌
文件不完整
李雁津2012
完整交城骏枣,
用自来水清洗表面后再用无菌水冲洗,晾干称重后浸入30%的乙醇中3min
浸入2.6%的次氯酸钠溶液中5min
浸入30%的乙醇中30s进行表面消毒,最后用无菌水冲洗5次,晾干
用无菌剪刀将枣果去皮,果肉剪碎,加入无菌生理盐水研磨
取最后一次淋洗水150微升涂于LB平板上,28°
C培养72小时,检测表面灭菌效果。
将碾磨液分别涂布于胰酶大豆琼脂培养基(TSA)、任氏培养基(R2A)、金氏培养基(KMB)、肉汁胨培养基(BPA)、LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基(YPM)、无氮培养基,28°
C培养箱中倒置培养3-7天。
张慧茹
挑选新鲜、生长旺盛的葎草,用保鲜袋包装
用自来水冲洗干净,置无菌操作台中紫外灯照射5min后晾干。
用75%酒精进行全草消毒1min
升汞消毒时间分别为:
根65s、茎50s、叶35s。
再用无菌水冲洗干净
将上述组织块剪成0.5cm×
0.5cm大小
分别取各种组织最后一次冲洗的无菌水,涂布于营养琼脂平板上;
将表面消毒处理过的完整的根、茎、叶各组织贴压在PDA培养基平板内;
在超净工作台内放置一敞开的PDA平板。
将上述3种对照平板置于28℃恒温培养箱内培养7d,用于检查表面灭菌效果。
置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中,28℃恒温培养箱中培养约5~7d,待内生菌长出后,挑取单个菌落进行纯化,PDA培养基斜面保菌。
李勇
健康人参
自来水将人参根表面粘连的土壤清洗,再用无菌水冲洗1次
依次用70%乙醇浸泡3min
2.6%次氯酸钠浸泡5min,再用70%乙醇浸泡30s。
最后用无菌水淋洗5次
将无菌人参根剪成碎块,放入无菌研钵中,加入适量无菌石英砂和生理盐水(0.85%),充分研磨,梯度稀释1万倍
取最后一次淋洗液150μL涂平板,28℃培养3d,观察平板上是否有菌长出
。
取200μL稀释液至细菌分离培养基,涂布均匀。
25℃恒温培养7d,记录每个平板上的菌落形态及菌落数,纯化培养。
林娜
随机挑选100g左右根、茎、叶、果实
洗净风干
75%乙醇分别浸泡2、3、1、1min,无菌水冲洗6次,无菌滤纸吸干
0.1%HgCl2分别浸泡50、60、40、40s,无菌水冲洗6次
加无菌石英砂研磨,梯度稀