实验四植物抗逆生理Word格式文档下载.docx

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（2）生物膜破坏：

类囊体膜含有大量的糖脂和不饱和脂肪酸，与光化学反应密切相关。

膜脂的不饱和度增加有利于类囊体膜光合特性的维持。

盐胁迫下，Na+可置换细胞膜结合的Ca2+，膜结构遭到破坏，功能改变。

细胞膜选择透性遭到破坏，细胞内的钾、磷和有机溶质外渗，胞外离子如钠、氯大量进入细胞，造成胞内离子平衡破坏。

研究证明NaCl胁迫对植物的伤害主要伤害了细胞的质膜，使膜脂发生过氧化，导致过氧化产物MDA增加，质膜透性加大，细胞内离子平衡失调，代谢紊乱，生长受到抑制。

（3）生理紊乱：

盐分过多会降低蛋白质的合成速率，相对加速储藏蛋白质的水解，造成体内氨基酸的积累过多，产生过多的氧自由基和氨，对植物造成伤害。

盐分过多也抑制光合速率，叶绿体趋于分解，叶绿素被破坏，叶绿素和胡萝卜素的生物合成受干扰，气孔关闭，光合下降。

总之，在盐分胁迫下，植物会产生一些反应，以忍受或适应盐的环境。

1实验材料、试剂与设备

1.1实验原材料

小麦经过不同浓度的盐溶液（0、0.2%、0.4%）处理24h后的新鲜小麦

1.2实验试剂和仪器

1.2.1叶绿素含量测定

95%乙醇（或80%丙酮）；

石英砂；

碳酸钙粉；

仪器：

剪刀，分光光度计，电子天平，研钵，棕色容量瓶，漏斗，滤纸，吸水纸，胶头滴管。

1.2.2脯氨酸含量测定

2.5%酸性茚三酮溶液的配置：

将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于4℃冰箱中，2-3日有效；

3％磺基水杨酸配配制：

3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；

6mol/L磷酸：

85%磷酸稀释至原体积的2.3倍；

10μg/ml脯氨酸标准母液配制：

精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg/ml脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml，加蒸馏水稀释定容至100ml，即为10μg/ml脯氨酸标准液；

100μg/ml脯氨酸母液:

称10mg脯氨酸溶于少量的乙醇中，用蒸馏水定容至100ml；

冰醋酸；

甲苯。

分光光度计；

电子分析天平；

离心机；

小烧杯；

普通试管；

移液管；

注射器；

恒温水浴锅；

漏斗；

漏斗架；

滤纸；

剪刀；

洗耳球。

1.2.3细胞膜透性测定

蒸馏水，去离子水；

电导仪，电子天平，三角瓶，吸水纸，剪刀，恒温培养箱，真空泵。

1.2.4过氧化物酶（POD）活性的测定

POD提取液；

100mmol/LPH为7.0的磷酸缓冲液PBS；

反应混合液：

100mmol/L磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入邻甲氧基苯酚28ul，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19ul，混合摇匀，保存于冰箱中。

1.2.5丙二醛（MDA）含量的测定

10％三氯乙酸；

0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液；

10％三氯乙酸：

称取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml；

0.6％硫代巴比妥酸（用10％三氯乙酸配制）：

称0.6707gTBA加10％TCA溶解定容至100ml（4℃贮存）。

仪器：

离心机，离心管，分光光度计，电子分析天平，恒温水浴，研钵，试管，移液管，试管架，移液管架，洗耳球，剪刀。

1.2.6可溶性糖含量的测定（蒽酮法）

1.材料：

植物叶片。

2.仪器设备：

离心机，离心管，分光光度计，电子分析天平，恒温水浴，研钵，试管，移液管，试管架，移液管架，活性炭，漏斗，剪刀，玻璃棒。

3.试剂

（1）浓硫酸；

（2）80％乙醇。

（3）葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：

准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）。

（4）蒽酮试剂：

称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。

2实验设计

将种植的小麦用不同浓度梯度的盐溶液提前24小时预处理，盐溶液的浓度分别为0、0.3%、0.6%，0梯度的作为对照，做三次重复。

3实验步骤

3.1叶绿素含量的测定

1取新鲜植物叶片（或其它绿色组织），擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀；

2称取剪碎的新鲜样品0.2g，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。

静置3～5min；

3取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中；

4用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中,直至滤纸和残渣中无绿色为止。

最后用乙醇定容至25ml，摇匀；

5把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。

3.2脯氨酸含量的测定

3.3.1脯氨酸标准曲线的制作

1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12ug的脯氨酸标准液。

加入表中试剂后，置于沸水浴中加热20min。

取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

试剂

管号

1

2

3

4

5

10μg·

ml-1脯氨酸标准液（ml）

蒸馏水（ml）

冰醋酸（ml）

2.5﹪酸性茚三酮（ml）

0.2

1.8

0.4

1.6

0.6

1.4

0.8

1.2

1.0

2用移液管轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

3标准曲线的绘制

以脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.3.2样品的测定

1脯氨酸的提取

称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

2测定

吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸、2mlH2O、3ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热20min，溶液即呈红色。

冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml（实际上只吸取了5ml，测定时只用了2ml）；

用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

3.3POD酶活性的测定

1取样取0.3g左右的叶片，放在冰凉的研钵下，加入POD提取液4ml，快速研磨，研磨完成后，直接倒入离心管中，放到4℃冰箱冷藏。

（做3次重复）；

2离心调整离心机的转速和时间，12000转下离心6min，离心温度在-4~4℃；

3反应步取上清液40微升（0.04ml）于试管中，加入3ml反应液，混匀，之后放在35℃水浴中保温5min；

4比色在470nm下，用POD提取液作为调零液，测得数据。

3.4膜透性的测定

1选用18个三角瓶，分为三组，每组六个，第一组三角瓶中加入未用KNO3处理的小麦叶片，叶片蒸馏水冲洗干净，然后用吸水纸吸干水分，用剪刀把叶片剪成1cm的小段，每个瓶中准确称量0.5g叶片，再往每个瓶中加入10ml去离子水，六个瓶中三个为A处理，三个为B处理；

第二组的六个三角瓶中加入用0.3%梯度KNO3处理过的叶片0.5g，都加入10ml蒸馏水，分成A、B两个处理；

用0.6%梯度KNO3处理过的小麦叶片也是同上面的步骤一样；

2把所有的三角瓶抽真空20min；

3测定每组中A处理的电导率；

4将每组B处理的三角瓶用保鲜膜封口，放入恒温培养箱中80℃下处理15min，取出冷却至室温，测定他们的电导率；

3.5丙二醛（MDA）含量的测定

1提取

采用硫代巴比妥酸显色法。

取叶片，洗净擦干后去中脉。

称取0.5g样品，加5%三氯乙酸2mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000rpm，离心10min。

2显色

取上清液2mL，加0.6%TBA2mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。

分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。

3.6可溶性糖含量的测定（蒽酮法）

3.6.1可溶性糖的提取

称取0.5g的新鲜植物（青菜）叶片，于研钵中加80%酒精4ml，仔细研磨成匀浆，倒入离心管内，置于80℃水浴中不断搅拌30min，离心10分钟（5000转/min），收集上清液于10ml的刻度试管中，其残渣加2ml80%酒精重复提1次，合并上清液。

在上清液中加0.5g活性炭，80℃水浴脱色30min,定容至10ml，过滤后取滤液（稀释10倍或20倍后）测定。

3.6.2显色及比色

吸取上述糖提取液1mL，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。

从标准曲线上查得滤液中得糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。

3.6.3绘制标准曲线

取标准葡萄糖溶液将其稀释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每mL含糖0、5、10、20、40、60、80μg。

按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A625－糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。

试剂（ml）管号

123456

葡萄糖标准液00.050.10.20.30.4

80%酒精1.00.950.90.80.70.6

蒽酮-硫酸试剂555555

葡萄糖浓度（ug/ml）01020406080

3.6.4计算方法

可溶性糖含量% 

= 

C*V/（W*106）*100% 

V为植物样品稀释后的体积（ml）----