蛋白质组学整理2014(修改版)Word文档格式.doc
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简答题:
1.基因组与蛋白组的区别与联系
(1)同一性与多样性:
同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的;
对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下,蛋白质组的构成是不同的
(2)有限性与无限性:
基因组无论大小,其核苷酸的数量和序列是一定的,对基因组序列的测定是一种“有限”的工作;
由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰,包括磷酸化、糖基化、酰基化等,很难确定蛋白质组的蛋白质数量;
对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。
(3)静态与动态:
一个个体的基因组自个体诞生到死亡,始终保持不变;
个体的蛋白质组,作为新陈代谢的主要执行者,在个体的生命活动中却总是变动的。
(4)周期性与空间性:
基因组通常位于细胞核内,比较稳定,序列和功能一般不受空间的影响,但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期,mRNA的表达是不一样的;
不同的蛋白质分布在细胞的不同部位,它们的功能与其空间定位密切相关;
许多蛋白质在细胞内不是静止的,他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用。
2.重点:
基因组与蛋白组的区别与联系:
区别/联系
基因组
蛋白质组
同一性与多样性
对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下,蛋白质组的构成是不同的。
有限性与无限性
基因组无论大小,其核苷酸的数量和序列是一定的,例如人类基因组长度为32亿个碱基对;
对基因组序列的测定是一种“有限”的工作。
静态与动态
周期性与空间性
孤立作用与相互作用
基因组表达的各种mRNA是彼此孤立的,互不干扰;
蛋白质组中的各种蛋白质却是彼此间有着广泛的相互作用。
单一手段与多种技术
在基因组研究中,DNA测序技术是最基本和最主要的工具,因为基因组的均一性和简单性使得一种单一的技术就能胜任基因组的研究任务;
在蛋白质组研究中,需要的研究技术远远不止一种,并且技术的难度也远远大于基因组的研究技术。
第二章蛋白质概述
1.等电点:
在某一pH的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,成为兼性离子,呈电中性。
此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。
2、蛋白质是一切生物体中普遍存在的,由20种左右天然α-氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物;
简答题
3、氨基酸的分类、光学性质、重要化学反应
1)非极性(疏水性)氨基酸(8种)A丙氨酸Ala、V缬氨酸Val、L亮氨酸Leu、I异亮氨酸Ile、F苯丙氨酸Phe、W色氨酸Trp、M甲硫氨酸Met、P脯氨酸Pre
2)极性(亲水)中性氨基酸7种G甘氨酸Gly、S丝氨酸Ser、T苏氨酸Thr、C半胱氨酸Cys、Y酪氨酸Tyr、N天冬酰胺Asn、Q谷氨酰胺Gln
3)碱性氨基酸3种H组氨酸His、K赖氨酸Lys、R精氨酸Arg
4)酸性氨基酸D天冬氨酸Asp、E谷氨酸Glu
2、光学性质
1)除甘氨酸外,所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子,这其四个不同的取代基可有两种不同的空间排列方式,L型和D型。
它们具有相反的旋光性,也称分子手性。
蛋白质分子中的氨基酸一般为L-型。
2)参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统,在紫外光区(220-300nm)显示特征的吸收谱带,最大光吸收(λmax)分别为279、278、和259nm。
由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基,因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。
3、重要化学反应
1)与茚三酮反应:
用于氨基酸定量定性测定.
2)与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应(sanger反应),用于蛋白质N-端测定.
3)与苯异硫氰酯(PITC)的反应(Edman反应),用于蛋白N-端测定,蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。
(初级蛋白质测序)除脯氨酸与羟脯氨酸外,可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。
脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。
第三章蛋白质样品的制备
可能会出论述题:
蛋白质样品的制备包含蛋白质分离、提取与纯化3个过程。
1.样品制备的原则
(1)全息性,尽可能采用简单方法进行样品处理,以避免蛋白丢失,尽可能获得所有的蛋白质。
(2)应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。
(3)细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。
(4)防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
(5)样品裂解液应该新鲜配置,并且分装冻存于-80℃。
勿反复冻融已制备好的样品。
(6)通过超速离心清除所有的非蛋白杂质,尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。
(7)防止发生人为的蛋白质样品化学修饰,如加入尿素后加温不要超过37℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白。
2.制备流程
分为组织活细胞破碎、分离或沉淀蛋白质、纯化蛋白质。
后两步往往是结合在一起进行的。
1)组织活细胞破碎的原则是,在整个过程中最大限度的限制蛋白质的水解和其他形式的蛋白质降解。
2)沉淀溶液样品中的蛋白质,清除杂质是可选择的步骤,主要依赖于样品本身和研究目的,通常建议采用最简单的样品制备方法。
3)蛋白质的纯化是对沉淀的蛋白质进行再溶解,重复沉淀的过程,通常利用冲泡胀溶液稀释样品。
样品破碎与分离蛋白质
3.组织与细胞破碎
(一)温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品,例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物,或者用于分析某一特定的细胞器,例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。
(二)剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞,如固体组织内的细胞,或具有坚硬细胞壁的细胞,如酵母细胞,这种方法可以使细胞完全破碎裂解。
4、蛋白质沉淀
这是一种可选择的方法。
如果样本十分重要,想得到完整而精确的样本蛋白质谱,应避免使用沉淀和重溶的方法。
蛋白质裂解
5、裂解液(各组分及其作用)
组成成分及作用:
⑴离液剂:
通过改变或破坏溶液中的氢键等次级键使蛋白质充分伸展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能量域。
尿素是常用的离液剂。
⑵还原剂:
还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键,让大多数蛋白完全展开,增加蛋白的溶解性。
⑶表面活性剂:
表面活性剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用,以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。
(4)起载体作用的两性电解质:
即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下,某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态,否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。
样品预分级
6.分步裂解提取
1.目的与原理
由于蛋白质在细胞中存在部位不同,而不同蛋白质的溶解性亦不相同,为了提高双向电泳的分离效果,有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。
2.方法:
分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐渐增加的。
第一步裂解液只含有40mmol/LTris,其余为去离子水,只溶解偏亲水性的蛋白。
第二步裂解液属传统的裂解方法,含有表面活性剂CHAPS、还原剂DTT、解聚剂Urea等成分,由于具有良好的溶解能力,可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白。
第三步裂解液中添加了能够促进疏水蛋白质溶解的成分,如表面活性剂SB3-10、还原剂DTT、解聚剂thiourea,主要溶解偏疏水性的蛋白。
在多数情况下,大部分蛋白质在第一步和第二步中可被提取。
清除影响电泳的图谱的杂质
样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分离及二维电泳图谱的质量,因此,在样品制备中需考虑清除这些杂质。
第四章蛋白质分离技术
1.双向凝胶电泳(2-DE):
利用蛋白质的等电点和分子量,结合凝胶化学特性,分离各种蛋白质的方法。
基本原理:
第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
2.聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel,PAG)是通过丙烯酰胺(acrylamide)单体和双功能团交联剂如N,N’-甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacrylamide)按一定的比例混合,在引发剂和增速剂存在下聚合而成的交叉网状结构,使其产生分子筛效应。
聚丙烯酰胺凝胶的优点
①机械强度高,弹性好,透明,无电渗作用,吸附作用极小;
②化学性质稳定,与待分离的物质不起任何化学反应;
③样品不易扩散,用量小;
④凝胶孔径可通过改变单体和交联剂浓度调节
⑤分辨率高。
3、IEF原理
等电聚焦电泳(IEF)是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同,在一个稳定的、连续的、线性pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。
所以利用等点聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子。
分析的条件是凝胶中有稳定的、连续的和线性的pH梯度。
pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。
在pH梯度凝胶内,在电场作用下,蛋白质分子能向使它们所带净电荷为零的点移动。
这就是等电聚焦效应。
1)pH梯度的形成
在电场下载体两性电解质的变化
天然pH梯度法:
在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为6.5左右)。
所有载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零。
引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移。
2)pH梯度的形成过程
pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度而定。
一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm,凝胶的厚度为1mm,使用Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度基本形成,2小时后无多大变化,如图
3)载体两性电解质的缺点
n 利用了合成载体两性电解质(SCA)来生成pH梯度,合成过程复杂,重复性小。
n SC