贵州省高三生物一轮复习 第四十讲 基因工程原理及技术文档格式.docx

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来源

大肠杆菌

T4噬菌体

功能

连接黏性末端

连接黏性末端和平末端

结果

恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

3.载体

（1）常用载体——质粒①化学本质：

双链环状DNA分子

②特点:

能自我复制；

有一个至多个限制酶切割位点；

有特殊的标记基因

（2）其他载体：

λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。

深度思考

如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，则图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序如何？

提示限制性核酸内切酶能将DNA分子切割为DNA片段，符合图中①；

DNA聚合酶在DNA复制过程中将脱氧核苷酸连接成DNA链，符合图中④；

DNA连接酶能连接不同的DNA片段，符合图中②；

解旋酶能打开DNA双链形成DNA单链，符合图中③。

故正确顺序应为①④②③。

二.基因工程的操作程序

1.目的基因的获取

（1）目的基因：

主要是指编码蛋白质的基因。

（2）获取方法：

①从基因文库中获取目的基因

②利用PCR技术扩增目的基因

③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成

2.基因表达载体的构建——基因工程的核心

（1）基因表达载体的组成：

目的基因、启动子、终止子、标记基因等。

①启动子：

a．位置：

位于基因的首端。

b．作用：

是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。

②终止子：

位于基因的尾端。

使转录在所需要的地方停止下来。

（2）构建目的：

①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；

②使目的基因能够表达和发挥作用。

3.将目的基因导入受体细胞

（1）转化：

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

（2）常用方法（连线）：

受体细胞　　　　　　　　导入方法

①动物细胞　　　　　　a．农杆菌转化法

b．显微注射法

②植物细胞c．基因枪法

d．感受态细胞法

　（Ca2＋处理法）

③微生物细胞e．花粉管通道法

【提示】　①－b　②－a、c、e　③－d

4.目的基因的检测与鉴定

方法

检测或鉴定目的

水平

DNA分子杂交技术

检测目的基因的有无

分子水平

分子杂交技术

目的基因是否转录

抗原——抗体杂交

目的基因是否翻译

抗虫或抗病接种实验

是否具有抗虫抗病特性

个体水平

基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。

已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—；

限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。

请据图分析：

切割目的基因时宜选择限制酶Ⅰ还是限制酶Ⅱ切割质粒呢？

请说明理由。

提示　由题图及题干信息知，目的基因两侧分别含—GGATCC—序列和－GATC－序列，若使用酶Ⅰ切割，只能切断一侧，不能切断另一侧，若使用酶Ⅱ切割，则可同时切断两侧，从而切出目的基因，同理，质粒中也含两种酶识别位点，且两识别位点均位于标记基因部位。

若使用酶Ⅱ切割质粒，则可同时破坏两个标记基因，使用酶Ⅰ切割则可保留GeneⅠ作标记基因，故切割目的基因应选择酶Ⅱ，切割质粒应选择酶Ⅰ。

要点精析

1.五种DNA相关酶的比较

作用底物

作用部位

形成产物

限制酶

DNA分子

磷酸二酯键

黏性末端或平末端

DNA连接酶

DNA片段

重组DNA分子

DNA聚合酶

脱氧核苷酸

子代DNA

DNA解旋酶

碱基对间的氢键

形成脱氧核苷酸单链

DNA（水解）酶

游离的脱氧核苷酸

2.限制酶和DNA连接酶之间的关系图示

（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。

（2）限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

（3）限制酶是一类酶，而不是一种酶。

（4）DNA连接酶起作用时，不需要模板。

①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。

②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

（2）具备的条件：

条件

适应性

稳定并能复制

目的基因稳定存在且数量可扩大

有一个至多个限制酶切割位点

可携带多个或多种外源基因

具有特殊的标记基因

便于重组DNA的鉴定和选择

4.限制酶选择的注意事项

（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。

（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；

如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

易错警示！

　基因工程操作基本工具的8个易错点

（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。

（2）限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。

（3）在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。

（4）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。

（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

（6）限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。

（7）基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。

基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；

膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

（8）基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。

5.基因工程操作的基本步骤

（1）目的基因的获取

目前有两种途径：

一是直接提取目的基因，如从基因文库中获取。

二是人工合成目的基因，常用的方法有化学合成法和反转录法。

（2）基因表达载体的构建

①基因表达载体的组成

②构建过程

（3）将目的基因导入受体细胞

细胞类型

常用方法

受体细胞

转化过程

植物细胞

农杆菌转化法

体细胞

将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上

动物细胞

显微注射技术

受精卵

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物

微生物细胞

Ca2＋处理增大细胞壁通透性

原核细胞或酵母菌

用Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收

（4）目的基因的检测与鉴定

试题精粹

1.下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是（　　）

A．用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个

B．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大

C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同

D．只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒

2.限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。

如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。

适于作为图示目的基因载体的质粒是（　　）

3.（2014·

山东文登三模，35）在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。

如图为获得抗虫棉的技术流程。

请据图回答。

（1）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：

目的基因的获取、________、将目的基因导入受体细胞、______________。

（2）A过程需要的酶有________和________。

（3）要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用________处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为________态；

然后将________在缓冲液中混合培养完成转化过程。

（4）含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过[C]________和[E]________。

如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入________。

（5）目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是______________。

这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________。

4.（2015·

河北唐山重点中学联考，51）下图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题。

（1）图中cDNA文库________基因组文库（填“大于”“等于”或者“小于”）。

（2）①过程提取的DNA需要__________的切割，B过程是________。

（3）为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法。

目的基因获取之后，需要进行________，其组成必须有__________________________

以及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。

（4）将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是________，其能否在此植物体内稳定遗传可以用________技术进行检测。

5.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列问题。

（1）若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割抗虫基因。

①过程在________（填“体内”或“体外”）进行。

（2）通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上，若大肠杆菌能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入，该培养基从功能方面属于________培养基。

（3）重组质粒导入大肠杆菌的目的是______________________。

（4）⑤过程所用技术称为________，从遗传学角度来看，根本原因是根细胞具有________________。

6.（2015·

福建质检，33）为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。

其基本流程如下图：

（Amp表示氨苄青霉素抗性基因；

LacZ基因被SHH基因插入后不表达）

请回答：

（1）重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，________（需要/不需要）启动子。

（2）步