在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略文档格式.docx
《在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略文档格式.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体[4]，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因[5，6，7]。
咱们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。
●有效表达载体的构型
构建表达质粒需要多种元件，需要认真考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。
表达载体的大体结构如图1所示[8]。
RBS
P
R-35-10SDcodingsequenceTTTetOri
-35-10Stopcodon
TTGACA（N）17TATAATUAAU
UGA
UAG
Startcodon
mRNA5'
UAAGGAGG（N）8AUG（91%）
16SrRNA3'
HOAUUCCUCCGUG（8%）
UUG（1%）
启动子（以杂和的tac启动子为例）位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调剂基因（R）操纵，调剂基因能够是载体自身携带，也能够整合到宿主染色体上。
的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核苷酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六核苷酸序列（-10区）组成[9,10,11]。
有许多启动子可用于在中的基因表达，包括来源于革兰氏阳性菌和噬菌体的启动子。
理想的启动子具有以下特性：
作用强;
能够严格调控;
容易转导入其他以便挑选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的[12]。
在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两头限定在-35（±
2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[13]。
Shine-Dalgarno（SD）位点[14,15]在翻译起始时期与16SrRNA的3'
端彼此作用[16]。
SD与起始密码子间的距离约为5-13bp[17]，而且此区的序列在mRNA转录物中应幸免显现二级结构，不然将会降低翻译起始的效率[18]。
在RBS的5'
和3'
端均为A丰硕区[19]。
转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号[20]和组成发卡结构的爱惜性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期[21]。
除上述对基因表达的效率有直接阻碍的元件之外，载体还含有抗生素抗性基因，以方便质粒的挑选和传代。
氨苄青霉素是最经常使用的抗性标记。
但在生产人用医治性蛋白时，最好选择其他抗性标记（如Tet）以幸免可能发生的过敏反映[22]。
质粒的拷贝数由复制起点决定。
在特殊情形下，选用失控复制子能够取得大量的质粒拷贝数和较高产量的质粒编码蛋白[23，24]。
但在另外一些情形下，选用超过pBR322的高拷贝质粒似乎并无益处。
而且已有资料说明，增加质粒的拷贝数降低中胰酶的产量，在高拷贝质粒中，强启动子的存在严峻阻碍了细胞的活性[25，26]。
●转录水平调控
1.启动子
能在中发挥作用的启动子很多。
这些启动子必需具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。
第一启动子的作用要强，待表达基因的产物要占或超过菌体总蛋白的的10-30%；
第二，它必需表现最低水平的基础转录活性。
假设要求大量的基因表达，最好选用高密度培育细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。
若是所表达的蛋白具有毒性或限制宿主细胞的生长，选用可抑制的启动子那么相当重要[27，28]。
例如，轮状病毒的VP7蛋白能有效地杀死细胞，因此必需在严格操纵的条件下表达[29]。
但在某些情形下，启动子的严格性并非合理，因为即便最小量的基因产物也能由于其毒性而杀死细胞。
如能灭活核糖体或破坏膜渗透压的分子对细胞来讲是致死性的[30]。
对宿主的毒性并非仅限于外源基因，某种自身蛋白的过量表达也能造成一样的结果。
如编码外膜磷脂蛋白的traT基因[31]。
另外，不完全抑制的表达系统会造成质粒的不稳固，细胞生长速度的下降和重组蛋白产量的降低[32，33]。
Lanzer和Bujard曾对经常使用的lac启动子-操纵子系统进行了普遍的研究，证明操纵子放在启动子序列的不同位置会造成70倍不同的抑制。
将17bp的操纵子置于-10和-35六聚体区之间所形成的抑制比将其放在-35区的上游或-10区的下游要高50-70倍[34]。
启动子的第三个特性是其简便和廉价的可诱导性。
大量生产蛋白质最经常使用的启动子是热诱导（λPL）和化学诱导（trp）启动子。
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导的杂交启动子tac[35]或trc[36]都是强启动子，在基础研究中应用很广。
但在大量生产人用医治性蛋白时用IPTG做诱导剂是不可取的，因为IPTG具有毒性而且价钱昂贵[37]。
IPTG的这些不足至今仍限制tac或trc强启动子在大量生产人用医治性蛋白中的应用。
编码热敏lac阻遏蛋白[38]的突变lacI（Ts）基因的显现使得目前能够对这些启动子进行热诱导[39，40]。
另外，还显现了一些新型载体，它们许诺在30℃对trc启动子进行严紧调剂。
最近还报导了两种不同的lac阻遏蛋白突变体，能够同时许诺热诱导和IPTG诱导[41，42]。
尽管野生型lacI基因也能热诱导，但不能对其进行严紧型调剂，且不能用于lacIq菌株，因为温度的转变不能遏制由lac阻遏蛋白的过量表达所造成的严紧性抑制[43]。
因此，该系统只能用用于生产对宿主菌无害的一些蛋白。
冷反映启动子尽管不象其他启动子那样取得普遍的研究，但已经被证明能在低温条件下进行有效的基因表达。
噬菌体λPL启动子的活性在20℃时最高，随着温度的升高，其活性慢慢降低[44]。
PL启动子的冷反映由整合宿主因子，一种与DNA结合的序列特异性多功能蛋白来正调控[45，46]。
要紧冷应激基因cspA启动子一样也被证明在低温具有活性[47]。
对cspA和PL启动子进行分子剖析，鉴定了在较低温度下参与增强转录的特异性DNA区域。
从而开发了一系列在20℃低温具有高活性的PL衍生启动子[48]。
选用冷反映启动子的大体原理是在15-20℃的条件下，蛋白质的折叠速度只受到轻微的阻碍，而作为生物化学反映，转录和翻译的速度将被充分降低。
这就为蛋白质折叠、产生有活性的蛋白和幸免非活性蛋白聚合体即包涵体的形成提供了充沛的时刻，而目的蛋白的最终产量并未减少。
最近新报导的一些启动子具有诸多诱人的地方,为选择新的高效表达系统提供了方便。
如超级强的pH启动子[49，50],重组蛋白的产量可达总蛋白的40-50%[51]。
但表达的水平会因不同的基因此有不同。
因为蛋白质的合成不仅依托于启动子的强弱，而且有赖于转录的效率。
人们通常只考虑启动子的核心区域，即-10和-35六核苷酸区和一15-19bp的距离序列。
但有人提出核心序列之外的元件也能刺激启动子的活性[52]。
许多研究也已证明，核心启动子上游的序列能够在体内提高转录起始的效率[53，54，55]。
Gourse等证明，位于rRNA启动子rrnBP1-35区上游的DNA序列即UP元件，能够在体内和体外提高转录效率30倍[56]。
UP元件是作为一个独立的启动子组件发挥作用的，因为将其融合到其他启动子如lacUV5中也能刺激转录[57,58]。
UP元件与其他启动子融合所表现的这种转录增强子效应，使其有望通用于高效表达系统。
尽管已经证明rRNA启动子P一、P2的超强能力[59]，但它们仍未被用于进行高水平表达，其要紧缘故是难以对其进行调控。
rRNA的体内合成从属于细胞增殖速度的操纵。
在细胞快速增殖期，P1和P2是活化的，当细胞处于生长的静息期，那么P一、P2被负调剂。
因此，rRNA启动子在前诱导期将持续活化。
在体内快速增殖的细胞中，P2的活性很弱，而且可诱导性差，但假设与P1分开，P2启动子的活性明显升高（达到P1的70%），且对应激反映灵敏。
这说明在天然的串联体中，P2是部份关闭的[60]。
Brosius和Holy[61]将lac操纵子序列插入到rrnBrRNAP2启动子的下游，在带有lacIq基因的菌株中成功地抑制了P2的活性。
转录活性是以氯霉素乙酰转移酶的产生和RNA的表达为标准的。
但是，P2构建体的活性只相当于tac启动子活性的1/2，而且当rrnBP1启动子被置于P2启动子下游时，不能完全抑制转录。
有人试取利用反转启动子的方向来严格调控rRNA启动子。
将rRNA启动子克隆于目的基因的上游，但转录方向相反。
利用λ整合位点和可调控的λ整合酶来实现启动子的反转，从而达到进行诱导的目的，而且，在高度活化的启动子上游有一强转录终止子将幸免在前诱导期可能显现的载体的不稳固性。
2.转录终止子
在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。
一种是依托六聚体蛋白rho的rho依托性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离。
另一种是rho非依托性转录终止，它特异性依托于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区，和位于该回文序列下游4-9bp处的dA、dT富含区[62,63]。
尽管转录终止子在表达质粒的构建进程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极为重要的作用。
贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵[64]。
这种效应能够通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来幸免。
一样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录[65]。
还有资料证明，由强启动子启动的转录会使转录通读到复制区，造成操纵质粒拷贝数的ROP蛋白的过量表达，从而致使质粒的不稳固[66]。
另外，转录终止增强mRNA的稳固性[67]，从而提高蛋白质的表达水平。
若是来源于rrBrRNA操纵子的两个转录终止子T1和T2串联，那么成效更好[68]。
但其他的许多转录终止子通常情形下都是十分有效的。
3．转录抗终止子
细菌中许多参与氨基酸生物合成的操纵子在其第一个结构基因的5'
端含有转录衰减子。
衰减子由特定操纵子的氨基酸产物调剂。
如此关联的带电荷tRNA的存在就会在核糖体剪切以后引导初始转录本中二级结构的形成。
若是没有关联的带电荷tRNA，那么会形成抗终止子结构，从而抑制终止子中发卡结构的形成和转录的终止[69]。
抗终止元件能使RNA多聚酶越过核糖体RNA操纵子中的rho依托性终止子即boxA[70,71]。
转录抗终止是有一个极为复杂的进程，其中包括许多已知和未知因子。
有关这方面的知识已有详尽的综述。
在此咱们要紧讨论抗终止元件在中表达外源基因的应用。
在表达系统中作用比较强、应用较广的一个启动子是噬菌体T7晚期启动子[72,73]。
该系统的活性依托于提供T7RNA多聚酶的转录单元。
RNA多聚酶的
升级会员 