凝胶成像及QuantityOne中文操作说明Word文件下载.docx

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QｕａntitｙＯne软件拥有与ｗiｎdows操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。

插入密码狗,打开QuａntｉｔyOne软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和工具栏。

File

图像打开、保存、引入、打印等操作

Ｍａtｃｈ

分子量估算、条带匹配分析

Eｄit

图像普通编辑操作

Vｏlumｎ

定量分析

Ｖiew

图像缩放、三维视图、看光密度值等操作

Analysis

浓度估算、克隆计数等分析

Ｉｍagｅ

图像旋转、翻转、裁切等操作

Rｅports

分析结果输出

Lａnｅ

泳道分析

Ｗｉnｄｏｗ

窗口分析

Baｎd

条带分析

Hｅlｐ

帮助、快捷菜单、软件注册等 

每个菜单的主要功能如下：

往下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表:

Quanｔiｔy　Onｅ软件Ｈｅlｐà

ＱuｉckGuｉdｅ快捷指南提示如何实现一个功能,如定量分析（ＶｏlumesQuiｃkGuｉde）,电泳条带分析（ＢandAｎalysis），差显分析（DifferｅntiaｌDiｓplayAnａlyｓｉｓ），克隆计数（CｏlｏnyＣｏuntingAnalｙsｉs）等。

快捷指南下有1,2，3…步骤，根据提示完成。

使用QｕantityOne软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像预处理、分析、结果输出四部分。

图像获取就是通过软件控制扫描仪（ＧS－800、PharosFX等）或凝胶成像系统（GelDoｃ、CheｍiDoc、VersaDｏc等）,图像预处理就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。

接下来是分析过程,根据分析的方法和目的不同,又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异（聚类）分析等等。

不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输出功能,得到我们想要的结果。

Qｕａnｔity　One软件提供了多种结果输出方式。

在接下来的几章里，我们将按照这个思路,一步步引导您使用这一软件。

第二章图像获取

Quantity　Onｅ4.４－4.6版本可以控制Bio-Rａｄ目前几乎所有的图像仪,如GeｌDｏcＸR、CｈemｉDocXＲS等。

这些图像仪采集到的图像,可以直接保存成软件可直接分析的图像,即扩展名1sｃ的原始图像文件。

下面将具体介绍如何通过QｕantityOne软件从GelDocＸR获取图像。

GeｌDocXR是Ｂｉo-Rad凝胶成像系统中最常用,操作最简便的仪器,它可以用来拍摄ＥB、ＳYBR　Green等染料染的核酸电泳凝胶;

Ｓyｐｒｏ　Ｒubｙ、银染、考马斯亮蓝等方法染的蛋白电泳凝胶；

以及化学显色的印记膜等。

使用GeｌDocXＲ之前,先接通电源,打开位于仪器背面右下角的电源开关;

然后根据具体的应用选择合适的照明和滤光片位置。

原则如下：

表格形式

模式1.如果样品是通过ＥB、ＳYBR　Grｅen、Sypro　Ruby等染料通过紫外激发来显色，就先将样品置于紫外透射平台（UVTｒansｉlluminatｏr）的中间，关上暗箱门,然后按下面板上的“TｒansUＶ”按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I”处。

模式2.如果样品是通过金属银、考马斯亮蓝等染料染色,就先将白光转换屏（WhitｅLightConversion　Ｓcreen）取下，打开下部的开关，放在紫外透射平台上,样品置于白光转换屏中间。

关上暗箱门，然后按下面板上的“Trans　White”按钮,并将滤光片选择杆置于位置“I”处。

ﻫ模式3.如果是化学显色等非透明可见样品，则用模式2中所示方法,将样品置于白光转换屏中间。

关上暗箱门，然后按下面板上的“EpiWhitｅ按钮”，并将滤光片选择杆置于位置“O”处。

接下来打开ＱｕantｉtyOne软件,选择　XR，按以下顺序操作：

① 

　按下Live/Focus,成像仪进入实时成像;

ﻫ②选择照明模式，一般核酸胶用UＶ,蛋白胶用Wｈｉte模式;

　注意,选择完成后，要按下成像仪面板上相应的光源按钮

③ 

此功能有三个上下键按钮：

IRIS（光圈），ＺOＯM（缩放），FOCUS（聚焦）,您可在软件上直接调节或在仪器面板上手工调节调节步骤:

ﻫa　调大IＲIS,以看到图像

b点ZＯOM,将胶适当放大 

ﻫｃ调节IRＩS至合适大小（一般情况下尽量选择小光圈，因为小光圈景深大，图像更清晰）

ｄ　调节FOＣUS，至图像最清晰按

④按“AutoExpｏse”；

如是,单击AutoExpoｓｅ,系统将自动选择曝光时间成像,如不满意，单击Manual　Ｅxpoｓe,并输入曝光时间（秒）,图像满意后保存,在自动曝光期间，图象会持续的输入到ＣCD中，直到达到一定比例的饱和象素值，此比例在Ｏpｔiｏｎsｄialoｇ　bｏx　中设定（默认值　=　０.１5％）。

一旦图象质量达到要求,点击Freezｅbuｔton来终止曝光。

⑤　如是蛋白凝胶，接第6步直接将清晰的图像保存即可

⑦　按下“Anaｌyｚe”;

这将会打开一个新的窗口来显示捕获的图象，该图象具有默认名称，具有日期、时间及用户名（如果已知的话）等信息。

⑧按下“Sａve”键,保存图像。

第三章图像分析

QｕantityOｎe的图像分析功能相当强大，根据不同的需要，可以分为定量分析、条带分析、相似性分析以及克隆计数（用于蓝白斑筛选）等等，而且每种分析法都有独特的优点和输出方式。

本章重点介绍常用的定量分析和条带分析方法,其余更细更深的功能请参考软件自带的用户手册。

一.定量分析（ＶolumnAnaｌysis）

定量分析是计算选定区域内信号强度的总和，是Ｑuaｎtiｔy　One最方便的定量工具。

这种分析方式考虑选定区域的真实形状，可用于电泳条带、斑点、大型芯片等图像的定量。

这种定量的方法可以扣除背景，可以按照用户的标准曲线计算出条带或斑点的浓度，但它不能计算分子量，也不能进行条带匹配和相似性分析。

ＱｕaｎtityＯnｅ软件称这类定量的结果为Volume。

Voｌｕme=选定区域内所有像素信号强度的总和×

像素面积ﻫ 

Volumｅ的单位：

int×

mｍ2

快捷指南VｏlumeｓＱｕick　Guｉdｅ，能够指导您对任意所选区域进行定量分析，此分析可以报告多种结果，常用的结果是相对浓度和绝对浓度（须提供标准品）。

具体的操作方法如下：

1.选择成像系统或打开已保存的文件（软件可以控制Biｏ-Rad所有的成像系统如ＧelDoc,ChemiDoc,ＶersaDｏc,GS-800，FX,如不是Bｉo-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff[1]文件格式,软件也可进行分析处理）

２.ZoomBox，缩放,对图象进行放大观察

3．Ｔrａnｓfoｒm转化，调节图象的对比度黑白

4．选择待分析区域：

ﻫVｏｌｕmnContour　Tｏoｌ等高线勾勒区域，自动连接浓度相同的点,如U１

VｏlumeFrｅe　ｈanｄToｏl自由画笔选择区域，可以勾勒出无规则形状,如U2

Vｏｌume　RecｔTｏol　矩形区域选择,如U3ﻫＶｏluｍnＣircle　Tool圆形选择区域，如U4ﻫ按上面4种方法选择需要定量的区域。

5.双击所选区域,出现如下窗口，定义样品类型，如未知样品Uｎkoｎwｎ（U1，Ｕ２…即待计算样品），背景Backgrｏund（B1,B２…,软件在算浓度时会将此区域的浓度自动扣除）　或标准样品Stａｎdａrd（Sｔd1,Stｄ2,　如果该样品是浓度标准样品，即定量标准,需在浓度concentrａtion一栏输入该样品的浓度）。

６．SelｅｃtTool选择不同区域

７．ＰrinｔImage打印图像

8．VolumｅＡｎalysisRepｏrt定量报告结果,打开出现如下窗口，选择要报告的参数,主要有２个参数Voluｍｅ、aｄj.Vol.（即adjｕsｔedｖoｌuｍｅ）和Ｃonceｎtration。

Ｖoｌｕｍe为定量值,adｊ.　Voｌ．　为扣除背景后的定量值,如有浓度标准样品（Sｔｄ）,软件可报告Cｏncentraｔiｏn绝对浓度。

参数选好后，按下按钮“dｏｎe”。

9.软件报告如下图所示：

按右侧输出按钮,可将表格保存成txt文件，按左侧打印按钮，可将报告打印出来。

二.条带分析（BanｄAnａlｙsｉs）

条带分析是ＱuａnｔityＯne最基本的分析工具,它可以自动识别电泳泳道和识别条带，依据泳道的平均光密度和条带宽度对每个条带进行模式化定量。

这种分析方式虽然不如定量分析来得方便，但这样可以实现非常复杂的电泳分析,满足各种不同的结果需要。

这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观因素而进行全自动定量。

ﻫ用条带分析的方法进行定量的结果叫TraceQuantｉty（TｒaceＱｔｙ）,计算方法是：

首先软件自动计算条带上每一横排像素的平均光密度和平均光密度分布曲线，然后每个具体条带的定量值是平均光密度曲线的线下面积的积分,即：

TraceQｕantity＝平均光密度×

条带上下边界的距离ﻫTraceQuantitｙ的单位:

OＤ*mｍ

下面介绍用此功能对泳道内的所有条带进行分子量确定,相对浓度分析 

1.打开已保存的文件（如不是Ｂｉo-Ｒａｄ成像系统所摄取的图象,将图象保存为Tiff　[１]文件格式，软件也可进行分析处理）

2．ＺoomBox，缩放，对图象进行放大观察

3.Transform转化,调节图象的对比度黑白

４．确定泳道（laｎe）,并对泳道进行各种调整（实际实验中泳道往往不是垂直的而出现各种变形）。

按下图所示在软件的工具栏中有一ＬaｎeＴooｌ图标,包含有更多泳道编辑工具。

ﻫ

5.选择Frame　Lanes,输入图像实际泳道（ｌane）数并确认。

此时图像上泳道的位置上会出现一条条红线,每条红线就代表一根泳道。

6．选择Aｄd/ＡｄjustAnｃhors，此时泳道红线上会出现一些小圆圈。

这些小圆圈称为锚定点（anchor）,锚定点规定了泳道走向。

当泳道不直时，点击出现弯曲的泳道部位,就可以增加锚定点。

鼠标按住锚定点,可以拖动锚定点,让每根红线始终位于泳道的中间线上。

７．LaneBａcｋground去除泳道背景。

点击该按钮,选择一条适当的泳道点击之,然后在弹出的对话框中选“ＡｌｌLａne　Ｏｎ”,在“Rｏllｉng　DiｓkＳizｅ”中填入适当的数值[1]。