非无菌产品微生物限度检查操作规程.docx

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非无菌产品微生物限度检查操作规程

非无菌产品微生物限度检查操作规程

1.0目的

规范微生物限度检查所用的培养基、检查方法、操作步骤、结果分析，以便对检品作出正确的微生物学评价。

2.0范围

本公司检品的微生物限度检查。

3.0职责

QC主管和QC检验员对本标准负责。

4.0参考或引用文件

《中华人民共和国药典》（2015年版）

《药品生产质量管理规范》2010年版

5.0内容

5.1简述：

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

5.2药品微生物限度检查法总则：

5.2.1抽样：

5.2.1.1供试品一般按批号随机抽样。

5.2.1.2抽样量一般为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。

5.2.2供试品保存：

5.2.2.1供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件不当而引起致死、损伤或繁殖。

5.2.2.2供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。

5.2.3培养基及其制备方法：

5.2.3.1胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基等照各自说明书上配制方法制备。

5.2.4供试品的检验量：

5.2.4.1一般供试品检验量为10g或10ml；贵重的或微量包装的供试品检验量可酌减。

要求检查沙门氏菌的供试品，其检验量为20g。

5.2.4.2供试品须取自2个以上的包装单位。

5.2.5计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验

5.2.5.1供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。

5.2.5.2供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。

5.2.5.3若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。

5.2.5.4菌种：

5.2.5.4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

规定程序培养各试验菌株。

5.2.5.5菌液制备：

5.2.5.5.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

5.2.5.5.2菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存期内使用。

5.2.5.6阴性对照：

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

5.2.5.7培养基适用性检査：

5.2.5.7.1微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

5.2.5.7.2接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定条件下培养。

每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

5.2.5.7.3被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5〜2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

5.2.5.8计数方法适用性试验

5.2.5.8.1供试液制备：

5.2.5.8.1.1根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

5.2.5.8.1.2常用的供试液制备方法如下。

如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。

5.2.5.8.1.3水溶性供试品：

5.2.5.8.1.3.1取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:

10供试液。

若需要，调节供试液pH值至6~8。

必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。

水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

5.2.5.8.1.4水不溶性非油脂类供试品：

5.2.5.8.1.4.1取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:

10供试液。

分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。

若需要，调节供试液pH值至6~8。

必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。

5.2.5.8.1.5肠溶制剂供试品：

取供试品，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂），置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1:

10的供试液。

必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。

5.2.5.8.2接种和稀释

5.2.5.8.2.1按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。

所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。

为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。

5.2.5.8.2.2试验组：

取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。

5.2.5.8.2.3供试品对照组：

取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

5.2.5.8.2.4菌液对照组：

取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。

如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适用性试验。

5.2.5.8.3抗菌活性的去除或灭活

5.2.5.8.3.1供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。

若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50%,可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。

5.2.5.8.3.1.1增加稀释液或培养基体积。

5.2.5.8.3.1.2加入适宜的中和剂或灭活剂。

中和剂或灭活剂可用于消除干扰物的抑菌活性，最好在稀释液或培养基灭菌前加入。

若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。

中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5~2范围内。

5.2.5.8.3.1.3采用薄膜过滤法

5.2.5.8.3.1.4上述几种方法的联合使用。

若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性，同时也表明供试品不易被该类微生物污染。

但是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。

因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。

若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检査。

5.2.5.8.4供试品中微生物的回收

5.2.5.8.4.1计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。

微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法。

5.2.5.8.4.2平皿法：

平皿法包括倾注法和涂布法。

每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。

5.2.5.8.4.3倾注法：

取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注人15~20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。

按表1规定条件培养、计数。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

计算各试验组的平均菌落数。

5.2.5.8.4.4涂布法：

取15~20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。

若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。

每一平板表面接种上述照“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液不少于0.1ml。

按规定条件培养、计数。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

计算各试验组的平均菌落数。

5.2.5.8.4.5薄膜过滤法：

薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。

供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。

滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。

使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。

油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。

供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。

总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。

取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml或10cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。

用适量的冲洗液冲洗滤膜。

5.2.5.8.4.6若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。

按规定条件培养、计数。

每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

5.2.6供试品检查

5.2.6.1操作步骤：

5.2.6.1.1开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min。

5.2.6.1.2操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴无菌衣、帽、口罩。

5.2.6.1.3操作前先用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封

5.2.6.2供试液制备：

按各类制剂制备供试液的方法制备。

5.2.6.2.1平皿法：

5.2.6.2.1.1平皿法包括倾注法和涂布法。

除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

5.2.6.2.1.2培养和计数：

除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20~25℃培养5~7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。

菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。

点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

5.2.6.2.1.3菌数报告规则：

需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀