基因操作实验讲义Word文档格式.docx
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用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开。
硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。
质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。
所有试剂均由试剂盒配套
①接种重组大肠杆菌一环于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
②取1.5ml离心管，倒入约1.5ml菌液。
8,000r/m离心30s。
弃尽上清。
③加入100L溶液1，彻底悬浮菌体。
④加入150L溶液2，颠倒离心管数次，使细菌完全裂解，溶液透明。
⑤加入150l溶液3，颠倒离心管6-8次，可见白色絮状物产生，室温放置10min，8,000r/m离心3min。
⑥在离心吸附柱中加入结合缓冲液（质粒提取专用）400l，再将上清液加入离心吸附柱中，混匀，8,000r/m离心30s。
⑦倒弃收集管内液体，在吸附柱内加入500l漂洗液，8,000r/m离心30s，洗去杂质。
⑧倒弃收集管内液体，8,000r/m离心30s，除去残留液体。
⑨将质粒纯化柱放在一干净的1.5mL离心管中，加入75l洗脱缓冲液（elutionbuffer）至管内柱面上，放置10min。
⑩8,000r/m离心30s，所得液体就是立即可用的超纯质粒。
1.3质粒的酶切与电泳鉴定
质粒的酶切
实验材料
质粒pLac18，上述实验提取
限制性内切酶EcoRI、HindIII：
宝生物工程（大连）有限公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助，包括酶20U/L，酶反应缓冲液等
实验步骤
1．取已灭菌的500L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12L，质粒5L，缓冲液M2L，限制性内切酶1L，混匀。
2．将上述溶液于37℃水浴30min。
酶切产物的电泳
实验材料和仪器
50×
TAE缓冲液：
Tris242g，冰醋酸57.1mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL，定容至1L
取50×
TAE缓冲液10mL，加入纯水至500mL
溴化乙锭溶液：
10mg，加水至1mL，充分溶解
琼脂糖：
华美公司分装Amresco产品
电泳槽：
迷你-31B型，北京六一仪器厂（含电泳槽，制胶槽）
电泳仪：
DYY-6B稳压稳流电泳仪
凝胶成像仪：
美国alpha2200
1．取50mL小烧杯一个，加入琼脂糖0.14g，加入TAE缓冲液20mL，在电炉上煮沸。
2．放置到约50℃时，加入溴化乙锭溶液1L，混匀，倒入制胶槽中，插上制胶梳子。
3．待凝胶凝固后，将凝胶放入电泳槽内，拔取制胶梳子。
4．取待检测DNA4L，加入0.5L加样缓冲液，混匀。
5．将加入了加样缓冲液的待测样品加入加样孔中。
6．打开电泳仪，调节电压至50V，保持稳压。
7．电泳约50min～，关闭电泳仪，小心取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察电泳结果。
实验二嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增以及PCR产物的纯化
2.1实验材料：
TaqDNA聚合酶（含Taq酶Buffer，dNTP）（注：
本实验中PCR反应试剂用上海赛百盛公司TaqPremix代替，该产品已经预先加入了水，TaqDNA聚合酶，酶反应缓冲液和dNTP，做PCR反应时只要加入特异性的模板DNA和引物即可），内切酶BamHI均为大连TaKaRa公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助。
小量PCR产物纯化试剂盒为上海生工生物技术公司产品。
2.2实验步骤
A淀粉酶基因的PCR扩增与鉴定
1．取200µ
LPCR管一支按顺序加入：
TaqPremix反应液47µ
L
引物:
2µ
嗜热脂肪芽孢杆菌染色体DNA1µ
94℃变性10min,
加入TaqDNA聚合酶5个单位。
2．混合后进行PCR反应
（94℃60s，58℃60s，72℃120s），经过20个循环后
在72℃延伸10min。
电泳鉴定PCR结果
B用硅胶柱纯化PCR产物
1.取PCR产物（50L），转移到一干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的BindingBuffer（PB），混匀。
2.将硅胶柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，室温放置2分钟；
3.倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，加入500L漂洗液（WashSolution），8,000r/m离心30s。
4.重复步骤4。
5.倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，8,000r/m离心30s。
6.将硅胶柱放入一干净的1.5mL离心管中，在硅胶柱的膜中央加入50LTEBuffer，室温10min。
7.8,000r/m离心30s，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
C.PCR产物的酶切鉴定
1.取已灭菌的500L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12L，质粒5L，缓冲液K2L，限制性内切酶BamHI1L，混匀。
2.将上述溶液于37℃水浴60min，50V电泳60min电泳鉴定酶切结果。
实验三感受态大肠杆菌JM109制备
3.1实验材料
0.1mol/LCaCl2，纯水配制，过虑灭菌
3.2实验步骤
1．挑取E.coliJM109单菌落于2ml液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2．取0.2ml培养液于20mlLB培养基中，剧烈振荡培养约1小时。
3．取1.5ml离心管，加入培养液1.5ml，冰浴15分钟，4℃，8,000R/M离心1分钟，弃尽上清液。
用预冷的0.1mol/L氯化钙溶液悬浮菌体，于冰水中放置15分钟。
4．8,000R/M离心1分钟，弃尽上清液，用预冷的100µ
l0.1mol/L氯化钙悬浮菌体。
5．冰水中或4℃放置12-24小时，用于转化。
实验四PCR产物和载体的酶切，纯化和连接
4.1实验材料：
核酸内切酶EcoRI、HindIII，试剂盒高效连接液（mighty），均为TaKaRa公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助。
小量DNA胶回收试剂盒为上海华舜公司产品。
连接试剂盒为TaKaRa公司产品。
4.2实验步骤
A．PCR产物酶切
取0.5mL离心管一支按顺序加入
超纯水7µ
经PCR纯化柱纯化的PCR产物：
10µ
缓冲液M：
2.0µ
核酸内切酶EcoRI、HindIII（混合物）1L
混匀，8,000r/m离心30s
37℃酶切3h
Ｂ．载体酶切
超纯水14µ
载体：
3µ
BufferM：
2µ
核酸内切酶EcoRI、HindIII（混合物）：
1µ
C．用硅胶柱纯化酶切载体及PCR产物
同实验2
D．PCR产物与载体的连接
取经酶切纯化的PCR产物4µ
L，载体1L混合
加入连接试剂盒高效连接液5µ
L，混合。
16℃反应过夜
实验五连接产物的转化与转化子鉴定
5.1实验材料：
感受态大肠杆菌
5.2实验步骤
1．取感受态细胞1支（大肠杆菌JM109），加入连接产物1µ
L。
2．于冰水中放置20-30分钟，42℃水浴准确计时90秒，冰浴5分钟。
3．各管加入LB培养基II0.5ml，37℃水浴45-60分钟，涂布氨苄青霉素平板（固体LB培养基II中加入氨苄青霉素至100µ
g/ml），37℃培养16小时。
实验六连接转化子的鉴定
6.1实验材料
6.2转化子的鉴定
1．挑取连接物转化子2个，在固体LB培养基II上划线分离，37℃培养过夜，各区一个菌落，分别接入10mL液体LB培养基II（氨苄青霉素100g/mL）中，37℃振荡培养过夜。
2．取菌液于1.5ml离心管，8,000r/m，1分钟离心收集菌体。
3.提取质粒（同实验1）
4．取10L质粒加入2LbufferM，1LEcoRI、HindIII酶混合液，混匀37℃反应30min。
12．酶切产物电泳，凡能产生一条两个片段，分别为2.4kb和1.4kb为所需重组质粒（pLac18-amy），划线分离并保藏转化子。
实验七重组大肠杆菌转化子酶活鉴定
7．1实验材料：
2％淀粉溶液
碘液：
2gKI，1gI2，加水致100mL
100mg/mLIPTG为Pharmacia公司产品
7．2实验步骤
1．挑取E.coliJM109（pLac18-amy）单菌落于10ml液体LB培养基II（氨苄青霉素100g/mL）中，37℃振荡培养过夜。
2.取100mL菌液于10ml液体LB培养基II（氨苄青霉素100g/mL）中，培养至对数后期，离心收集细胞。
分别以2mL下列液体培养基悬浮细胞：
A：
液体LB培养基
B：
液体LB培养基II
振荡培养4h。
2．培养液用超声波破碎（一秒隔一秒，30分钟）。
3．细胞破碎液分别与1%的淀粉溶液混合，于65℃保温1h，加入碘液检测淀粉酶活力。
附：
实验原理及详细实验步骤请参考《现代发酵微生物实验技术手册》（诸葛健等，化工出版社，2005）第六章
实验报告要简明，与讲义相同的步骤和方法不要写，直接写“参考实验讲义”，实验报告每组一份由班长林清收齐后交老师，最迟为下学期开学后第二周。
所有试剂和及核酸内切酶的使用必须在排长的指导下进行。
严禁用火焰烧枪灭菌，一经发现全排不及格！
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如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
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