我国菲牛蛭的研究概况Word文档格式.docx

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2002年谭恩光等［4］从广东产的菲牛蛭基因组中PCR扩增出水蛭素基因,并克隆和测序。

在此，本文仅对我国菲牛蛭的一些研究进行综述，为开发菲牛蛭资源提供参考。

1菲牛蛭地理分布、野生资源情况、生态习性和采收季节

菲牛蛭主要分布在菲律宾、泰国、越南等东南亚地区及中国的东南、中部和西南部地区。

由于有关我国菲牛蛭地理分布、野生资源情况以及生态习性和采收季节相关报道很少，因此，我们对广西区内具有代表性的灵川、象州、岑溪、博白、防城、隆安、田东等15个县的菲牛蛭品种生物学特征、资源数量分布、生态习性和采收季节进行调查，共收集到水蛭样品15份。

经外貌与形态特征的初步鉴定，与我国水蛭分类学专家杨潼所描述的菲牛蛭相同，说明区内分布的水蛭以菲牛蛭品种为主。

分布在区内各地的菲牛蛭，经体重测定差异不显着，但在数量上桂东南地区明显多于桂西北，钦州、防城野生资源比较丰富，罗城、巴马等地野生资源稀少。

数量分布的多寡与温度、雨量、湿度等气候因素有关，符合水蛭喜温、湿、热的特性。

通过样品的收集为优化种苗选择提供了丰富的物质基础。

菲牛蛭生态环境要求和生态习性：

根据野外的考察表明，菲牛蛭喜欢在土壤含铁量较高、水体呈弱酸性的环境中繁衍。

在野外多发现于荒芜的山塘和山冲田块或湿草地，尤其是土层深厚、土质疏松潮湿,各种水草生长旺盛,并且经常有耕牛、人活动，呈土畦式水体相对固定的环境中多见，常年耕作的田块和已开发养殖的山塘或大面积连体的水体中很少发现。

菲牛蛭的采收季节：

经调查发现，菲牛蛭对温度反应敏感。

水温在25～30℃时，活动最活跃，生长最快，也是繁殖的季节。

在野外当水温低于15℃时便停止活动，因此，每年的11月前后到次年的4月前后很少发现有菲牛蛭在水中活动，这时它们都进入泥土里越冬，这与其为冷血变温动物，冬季具有冬眠习性相一致。

这样菲牛蛭的采收时间宜选择在9～10月份，此时，气温下降，菲牛蛭生长速度减慢，但仍在水中，易于捕捉。

2菲牛蛭的化学成分

　菲牛蛭中脂肪酸分析苗艳丽等［5］对广西产菲牛蛭脂肪酸提取液进行气相色谱/质谱（GC/MS）分析,共分离出19个峰。

与标准谱库对照分析,鉴定了16个组分,脂肪酸的相对含量采用总离子流各色谱峰面积归一化法定量,结果见表1。

实验共鉴定了菲牛蛭中脂肪酸的16个组分,占脂肪酸总量的97.39%,其中饱和脂肪酸占%，不饱和脂肪酸占%。

饱和脂肪酸主要有硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等;

不饱和脂肪酸主要包括油酸、11-二十碳烯酸等。

其中含量最多的是十六烷酸，达到%，其次是9-十八碳烯酸,含量为%；

11-二十碳烯酸含量为%。

菲牛蛭中所含的单不饱和脂肪酸,如9-十八碳烯酸和11-二十碳烯酸的含量高于中药蚂蟥中的含量［6］。

表1菲牛蛭中脂肪酸的组成及含量

序号脂肪酸分子式（甲脂）相对含量（%）13-甲基十三酸C15H30O21.022十四酸（肉豆蔻酸）,8,12-三甲十三酸C17H34O27.434十四酸（异构体）C15H34O20.655十五酸C16H32O21.48614-甲基十五酸C17H34O2　-十六烯酸C17H32O23.968十六酸（棕榈酸）C17H34O2　-甲基-十六酸-甲基-十六酸十七酸，7，11，15-四甲基十六酸　-十八烯酸C19H36O212.53148-十八烯酸C19H36O25.8115十八酸（硬脂酸）-二十烯酸

　菲牛蛭中氨基酸的分析苗艳丽等［5］采用HPLC法，测定广西产菲牛蛭提取液中的氨基酸。

并采用内标法进行含量测定,结果见表2。

测定结果表明菲牛蛭中含有18种氨基酸，甘氨酸的含量最高为5　μg/g，其次是亮氨酸含量为2　μg/g。

其中含有人体必需的7种氨基酸,这7种必需氨基酸含量为5　μg/g，占氨基酸总量的%；

高于其他水蛭［7］中必需氨基酸的含量。

表2菲牛蛭中氨基酸的组成及含量μg·

g-1

氨基酸含量氨基酸含量△天门冬氨酸2胱氨酸谷氨酸*缬氨酸丝氨酸606.21*蛋氨酸组氨酸398.94色氨酸△甘氨酸5392.70*苯丙氨酸*苏氨酸520.21*异亮氨酸△丙氨酸1478.56赖氨酸899.29△精氨酸1637.35△*亮氨酸2*酪氨酸165.17脯氨酸

*为人体必需氨基酸；

△：

为含量较高的氨基酸

3菲牛蛭的生物活性成分及其药理学作用

　菲牛蛭素（Bufrudin）［8］菲牛蛭素是从菲牛蛭分出的一种多肽,由60多个氨基酸组成,分子量7000D，序列分析表明,其中50%～60%的氨基酸残基与水蛭素相同。

其立体结构和构型有待进一步研究。

它的作用机理与水蛭素（Hirudin）、森林山蛭素（Haemadin）相同，都是抑制凝血酶［9］。

黄爱民等［10］从广西产菲牛蛭消化液中分离出两种特异凝血酶抑制剂-菲牛蛭素A、菲牛蛭素B。

BDA分子量约为，等电点为；

BDB分子量为KD，等电点为。

紫外扫描发现，BDA在230nm处有最大吸收，而BDB的最大吸收则在200～210nm之间。

每1000ml水蛭消化液可以分离出菲牛蛭素A630μg,菲牛蛭素B615μg，收率菲牛蛭素A约为％；

菲牛蛭素B约为%。

　菲牛蛭及活性成分的抗凝血作用黄爱民等［11］用广西菲牛蛭中提取的两种菲牛蛭素在体外及动物体内进行抗凝血实验，结果表明：

菲牛蛭素A和B均能明显延长活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间及凝血酶时间，但两者的3个指标有明显差异性，其中菲牛蛭素A对凝血酶时间的作用最显着，菲牛蛭素B则凝血酶原时间的作用更强。

对于凝血因子，菲牛蛭素A对Ⅱ，Ⅷ，Ⅻ因子产生抑制作用，对Ⅴ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ因子无影响；

菲牛蛭素B则对Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ，Ⅻ因子产生抑制作用,对Ⅴ，Ⅸ，Ⅺ因子无影响。

广西菲牛蛭中的抗凝物质BDA、BDB均有很强的抗凝活性。

此外，李文等［12］用7种水蛭进行全血与血浆复钙时间试验，证实日本医蛭与菲牛蛭都表现了强大的抗凝血作用（样品在10min测试时间内不凝）。

湖北牛蛭的抗凝效果也十分突出。

　菲牛蛭及活性成分的抗血栓作用吴志军等［13］采用大鼠静脉血栓模型，研究了菲牛蛭制品的抗血栓与溶血栓作用。

结果表明，阳性药脑血康和4种不同物种的水蛭冻干粉样品具有明显的抗血栓作用，各物种抗血栓作用强度依次为菲牛蛭冻干粉日本医蛭冻干粉欧洲医蛭冻干粉宽体金线蛭冻干粉；

同等剂量的菲牛蛭全身冻干粉样品和阳性药脑血康具有相当的抗血栓与溶血栓作用，而菲牛蛭头部段冻干粉则比前两者溶血栓效果更佳。

黎渊弘等［14］用广西菲牛蛭提取物对家兔体外血栓、动脉血栓及大鼠静脉血栓进行抗血栓研究,结果表明，大（ATU）,中（ATU），小（ATU）剂量组与对照组相比，菲牛蛭提取物对家兔体外血栓形成有显着性差异,血栓抑制率为%～100%。

与对照组比较，给药组药后10，15min对大鼠半体内血栓形成影响有显着性差异（）,血栓的湿重明显减小或完全消失。

大鼠静注菲牛蛭提取物60ATU/kg后,大鼠静脉血栓形成率为0，血栓干湿重为0,与对照组比较有非常显着性差异（）。

家兔静注菲牛蛭提取物60ATU/kg前和给药后15，30，45min，家兔动脉血栓干湿重有显着性差异（），药物作用时间为1h。

　纤维蛋白溶解酶笔者采用纤维蛋白平板法［15］定性测定广西产菲牛蛭唾液提取液纤维蛋白溶解酶。

结果表明：

在标准平板和加热平板上加入广西产菲牛蛭唾液提取液20μl后，溶圈直径为cm，表明能溶解纤维蛋白。

而尿激酶20μl在标准平板上有较强的纤溶作用，在加热平板上无纤溶作用。

说明菲牛蛭唾液提取液的纤溶机制与尿激酶不同，是以直接纤溶为主。

菲牛蛭唾液提取液经过10%～100%硫酸铵处理，部分蛋白被沉淀，由于硫酸铵的量不同，溶圈大小也不同。

10%硫酸铵处理样品上清液的溶圈直径最大，80%硫酸铵处理样品上清液的溶圈直径最小。

　抗血小板聚集活性成分李文等［12］从7种水蛭对抗ADP或胶原诱导的血小板聚集的结果表明：

日本医蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表现了抗血小板聚集的作用。

其中以日本医蛭的效果最佳。

在mg/ml浓度下已表现抑制ADP诱导聚集的作用；

其次为菲牛蛭，在mg/ml时对血小板最大聚集率和1min时血小板聚集率都表现了显着抑制；

湖北牛蛭的抑制ADP诱导血小板聚集作用则需要较高浓度。

笔者也发现，25μl广西产菲牛蛭唾液提取液对ADP诱导的聚集表现90%的抑制。

　抑菌活性成分广西菲牛蛭唾液粗提液未发现抑菌活性，但是经过离心处理，对金色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈直径为cm。

可能是因为粗样中成分多而杂，进行抑菌检测时干扰大，而导致阴性结果。

经过离心，干扰蛋白被沉淀分离，显示阳性结果。

　　4菲牛蛭粗品和菲牛蛭素精品的制备［11］

　提取粗品先配制提取液，然后让菲牛蛭吸吮，待菲牛蛭充分吸饱后，再将其挤压，收集唾液，每隔3周可提取1次，每条可以反复提取5～6次，最后还可将整体冻干后粉碎作最后的提取。

　广西菲牛蛭素精品的分离纯化

　广西菲牛蛭素的粗提取广西菲牛蛭唾液提取液1000ml，用三氯醋酸进行酸沉；

4℃，8000r/min离心30min，弃沉淀，取上清液65～70℃保温30min，适当搅拌；

调pH值至中性，4℃，8000r/min离心10min，弃沉淀，保留上清液。

　广西菲牛蛭素的提取纯化

　DEAE-纤维素柱层析选用的层析柱长为30cm，直径cm。

将上清液加到已用mol·

L-1磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-纤维素柱上，以0～1mol·

L-1NaCl1000ml进行线性梯度洗脱，流速为1ml·

min-1，以每管10ml收集各蛋白峰，按Markwardt凝血酶滴定法测定各管蛋白峰的活性，收集具有抗凝活性的A1峰及B1峰。

　SephadexG-50凝胶过滤柱层析选用的层析柱柱长为100cm，直径cm。

取浓缩后的DEAE-纤维素柱的A1峰和B1峰，分离上样于已用mol·

L-1磷酸盐缓冲液平衡的SephadexG-50柱上，用相同缓冲液洗脱，流速为ml·

min-1，每管10ml收集蛋白峰，同法测定各蛋白峰的抗凝活性，分别收集具有抗凝活性的A2，B2峰。

　反相HPLC进一步纯化采用Waters2487DualλAbsorbanceDetector,Waters600controller,WatersTM600Pump.在UV210nm下，