生物化学实验口试题目及要点参考Word文档下载推荐.docx

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生物体系是复杂的，也是未知的。

我们根据生物体系中待测物质的物理或化学特性来建立含量的测定方法，如可针对待测物质的某一化学基团来进行含量检测，而在整个生物体系中，也有许多的其他物质具有这一性质，它们具有共性，如此一来，这样的非待测物质就会成为含量测定的干扰因素，影响结果的可靠度。

人们开始寻找更为可信的方法，去寻找针对其他理化性质建立测定方法，从而产生了多种含量测定方法。

但是生物大分子之间的共性非常多，所以方法总是有或多或少的干扰因素（可举例说明）。

在实际工作中，我们应该选择干扰因素小的方法。

根据自己的工作需要，如精度要求、可重复性等，来选择合适的方法。

3、酶活力测定的总体思路是什么？

为什么该类测定中都有所谓对照管的设计？

对照管的设计要注意什么？

1）酶活测定的总体思路是在最适条件下，测定酶促反应初速度。

2）由于测定酶活时，目标酶常常处于一个生物体系内，该体系较为复杂，为了确保我们所测的酶活为目标酶的酶活，需要设计对照管来消除干扰及影响。

设计对照管排除非酶促反应阶段酶促反应的影响。

在设计对照管时，要注意除其不发生目标酶的酶促反应外，其他外界条件均要与测定管一致，如底物含量，反应条件等。

4、在生物化学研究中，为什麽一般均要使用缓冲液？

在使用缓冲液时应注意哪些问题？

1）生物化学研究的对象生物大分子多为两性物质，如蛋白质、核酸等，拿蛋白质来说，其结构单元是氨基酸，氨基酸是两性的，它的某些基团的解离状态是受到pH影响的，“结构决定性质，性质决定功能”，这就导致蛋白质的性质和功能受到影响。

对于研究工作来说，多数需要测定生物大分子在特定活性下的特性，因此需要固定pH。

当然，缓冲液就具有维持和稳定特定pH的特定，所以常选用缓冲液。

2）在使用缓冲液时，一要注意根据目标物特性选择合适的缓冲范围；

二要考虑缓冲液组分和待测组分不能发生相互作用或者化学反应。

比如：

缓冲液组分有可能是酶的激活剂或者抑制剂。

再如，常用的磷酸缓冲液，在进行与ATP相关的实验时就不能使用，因为ATP水解产生磷酸根，会对缓冲液组分有所影响。

5、众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化b-淀粉酶的活力而测a-淀粉酶和测总酶活力的策略，极少看到采取钝化a-淀粉酶活力去测b-淀粉酶的活力，为什么？

这种设计思路说明什麽？

1）采取钝化b-淀粉酶的活力而测a-淀粉酶活力，在70℃时钝化b-淀粉酶，使其完全失去活性，此后采取骤冷处理方式，升温至40℃时，又不会恢复其活性。

而钝化a-淀粉酶，在pH3.7条件下钝化，使a-淀粉酶变性，等到恢复待测定酶活最适pH时，a-淀粉酶则有可能会复性。

此外，调节pH时一般需要使用缓冲液，那么就要考虑到缓冲液中的组分（如某些离子）有可能是所测酶的激活剂或者抑制剂，这样一来所测酶的活性就不准确了。

相比较而言，温度变量是容易控制的，而且高温对a-淀粉酶活性基本无影响，却对b-淀粉酶有较好的钝化作用，并且在测定过程中我们没有引入其他的影响因子。

2）说明在实验设计中，要注意考虑方法的可行性、科学性以及相关因素的干扰。

6、紫外法测定RNA含量时，为什么要固定测定液的pH值，若pH值不固定，会影响测定结果吗？

为什么？

在测定RNA含量之前需用2%氨水调pH7.0。

这样做的原因有以下几个：

（1）核酸在过酸或者过碱条件下，双螺旋区会发生氢键断裂，紫外吸收升高，这种现象称为增色效应。

此外在不同pH溶液中，嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收也随之表现出明显的差异。

而紫外法通过测定OD260值来计算RNA含量，因此需要排出相关变量对紫外吸收的影响。

（2）核酸的摩尔消光系数（比消光系数）ε（ρ）并不是一个确定的值，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化，其经典数值均是在pH=7.0条件下测得的，故使用比消光系数法测RNA含量时需要调节pH7.0。

（3）生理pH7.0条件下有利于核酸的溶解，使核酸样品尽可能多的溶解，测定结果更准确（次要原因）。

7、利用分子筛层析分离物质时，流速和柱长对分离效果有何影响？

（首先应对分子筛层析的原理进行一定的阐述，与后续问题的回答进行因果联系：

当待测物质被洗脱通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。

半径接近或超过网眼半径的分子，不进入凝胶网眼之中。

被排阻的粒子受到的阻滞作用小，在重力作用下随着溶剂在凝胶颗粒之间沿着较短流程向下流动，移动速度快而先流出层析柱；

而半径小于网眼半径的分子可完全进入凝胶颗粒内部的网眼之中，它们被洗脱时要经过逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后流出层析柱。

从而样品中混合物根据分子大小的不同被分离开来。

）流速过快时会使小分子物质改变原来的洗脱途径，大分子物质与小分子物质之间的速度差异不明显，在一定时间内，速度差异所累积的距离也并不明显，会影响分离效果，流速过慢时大分子物质速度的优势也得不到体现，同时花费时间很长，扩散现象明显，会影响分离效果。

柱长过短时，物质分离不充分时便被洗脱，影响分离效果，柱长过长时，扩散现象明显，操作不方便影响分离效果。

8、何谓电泳现象？

生物大分子可以利用电泳技术进行分离、分析、鉴定的基本理论原理。

1）电泳现象，即带电粒子在电场中能够向与其所带电荷相反方向的电极泳动，是自然界中普遍存在的现象。

2）由公式v=E∙q6πγη可以看出，粒子移动的速度（v）与电场强度（E）和粒子所

带电荷量（q）成正比，而与粒子的大小（γ）和溶液的粘度（η）成反比。

此外，非球形粒子（如线形DNA分子）在电泳过程中会受到较大的阻力，即粒子移动速度还与其形状有关。

生物大分子如多肽、蛋白质、核酸等都具有可电离基团，它们在一定的pH条件下，每一个分子都会带有特殊种类以及数量的电荷，再加上大小以及形状的差异，这些分子在相同电场的作用下会产生不同的迁移速度，经过一定的时间便会集中到特有的位置上而形成紧密的泳动带，这便是对生物大分子进行分离、分析、鉴定的基本理论原理。

9、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦过氧化物酶同功酶试验中，为什么要梯度上样？

染色后电泳图谱能反映样品哪些信息？

1）梯度上样：

在上样时，采取梯度上样策略。

这是为了获取更多、更全面的信息。

在上样量多的条带上，我们可以发现蛋白含量最少，颜色最浅的条带，在上样量少的条带上，我们可以明显地看出颜色深浅的差异，发现条带中酶活的差别。

此外，我们还可以得到针对一份样品的最适上样量。

2）①同工酶的种数：

一般来讲，不同的谱带是不同的蛋白质；

②各种同工酶的含量：

谱带宽的酶量含量多；

③酶的活性：

染色的深浅可以对此进行反应；

④酶移动的速率差异：

通过条带离起点的位置可以看出。

（含量高，酶活强的谱带颜色深，可能宽些）

10、中性盐沉淀中硫铵分级沉淀是蛋白质粗分级中最常用的手段，为什么？

在进行实际操作时要注意什么？

1）（原理：

大量中性盐加入使水活度降低，它们在争夺溶剂水的同时破坏蛋白质表面的水化层，使疏水氨基酸暴露，从而发生聚集沉淀下来。

）①中性盐硫铵分级沉淀是粗分级中较为精细的一种方法，随着硫铵浓度的上升，能够破坏水化层厚度增加，而不同蛋白质分子的双电层水膜厚度不一，所以稳定性就有差异，因而不同浓度的硫酸铵对沉淀的目标蛋白具有一定的选择性；

②硫酸铵是中性盐，不破坏蛋白质的空间结构；

③硫酸铵在水中的溶解度大、温度系数小，在低温时仍可以高浓度存在，既能够满足低温沉淀某些蛋白质的需要，又能有效争夺溶剂水和破坏蛋白质水化层，使蛋白质有效沉淀；

④在同等浓度下，硫酸铵溶于水后形成二价离子，离子强度高，更能有效降低蛋白质溶解度；

⑤硫酸铵溶解性好也为后续的高盐纯化做准备，便于洗涤去除。

2）硫铵沉淀操作要注意边加边搅拌，因为该沉淀属于包裹性沉淀，加入时搅拌，避免局部硫胺浓度过高，沉淀出非目标蛋白。

（且在实际操作中要注意根据蛋白所需的硫酸铵浓度来确定加入硫酸铵物质的形态，如为50%以上的沉淀度，则需要加入固体硫酸铵）

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