流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程Word下载.docx
《流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程Word下载.docx（26页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
核酸染料
AnnexinV-Biotin（Cat.No.65872X）
Streptavidin-FITC（Cat.No.13024D）
PI（Cat.No.66211E）或
7-AAD（Cat.No.34321X）
AnnexinV-FITC（Cat.No.65874X）
PI（Cat.No.66211E）
AnnexinV-PE（Cat.No.65875X）
6.FACS流式细胞仪：
上样检测。
7.CELLQuest软件：
获取和分析试验数据。
8.AnnexinV检测对照管：
A-阴性对照
B-补偿1
C-补偿2
Biotin
SAv-FITC
AnnexinV-Biotin
和SAv-FITC
PI和
PE
未染色细胞
AnnexinV-PE
7-AAD
FITC
AnnexinV-FITC
PI
操作步骤
1.取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1⨯BindingBuffer缓冲液制成1⨯106
细胞/ml的悬液。
3.Falcon试管中加入100µ
l细胞悬液。
4.按以下体积加入AnnexinV与核酸染料：
管号
名称
荧光标记AnnexinV
核酸染料：
1
阴性对照
-
2
单阳1
AV-FITC
3
单阳2
4
样本
5.轻轻混匀，室温（20︒C~25︒C）避光处放置15分钟。
6.*使用AnnexinV-Biotin试剂进行检测时：
1⨯BindingBuffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
1⨯BindingBuffer缓冲液100µ
l溶解SAv-FITC试剂0.5µ
g，加入到细胞管中。
轻轻混匀。
加入5µ
lPI，室温（20-25︒C）避光处放置15分钟。
7.各试验管中分别加入1⨯BindingBuffer缓冲液400µ
l。
8.1小时内上流式细胞仪测定结果。
结果分析：
以下4个样本分别是阴性对照、AnnexinV单阳管、PI单阳管和试验管。
100
101
102
FL1-Height
103
104
100101102103104
Annexin
AnnexinVBlocking
待测细胞与未标记的重组AnnexinV预孵育，然后进行实验，是AnnexinV细胞凋亡检测的质量控制。
原理是预先阻断AnnexinV-FITC的结合位点，这样可以证明AnnexinV-FITC凋亡分析的特异性。
1.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1⨯BindingBuffer缓冲液制成1⨯106
2.在5ml的培养管中加入100µ
l细胞悬液（约1⨯105个细胞）。
3.加入5-15µ
g纯化的重组AnnexinV。
注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其AnnexinV位点饱和所需要的纯化的重组AnnexinV含量不同。
某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.5⨯105个细胞加5-15µ
4.轻轻混匀，室温反应15分钟。
5.加入5µ
l的AnnexinV-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。
6.各试验管中分别加入1⨯BindingBuffer缓冲液400µ
7.1小时内上流式细胞仪测定结果。
8.结果分析：
下图A、B为Anti-Fas抗体诱导3小时后的JurkatT细胞,图C、D为未处理的细胞；
图A、C为AnnexinV-FITC染色的凋亡检测结果，图B、D为AnnexinVBlocking后的检测结果。
PharMingen推荐AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒
规格
货号
AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitI:
PartA：
AnnexinV-FITC（100tests）PI（2ml）
1⨯BindingBuffer缓冲液（50ml）
100tests
6693KK
AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitII（AnnexinVBlocking）:
PartB：
PurifiedRecombinantAnnexinV（100µ
g）
6710KK
凋亡细胞的DNA断裂片段分析
在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现DNA断裂片段。
核酸酶将染色质的高级结构断裂为50-300kb的片段，最终断裂为200bp大小的DNA碎片。
DNA碎片检测的方法是外源性TdT酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL”（terminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling）。
现在可以使用APO-DIRECTKit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA断裂，造成DNA链3’-OH增多的情况。
在APO-DIRECT分析中，TdT酶催化DNA单链和双链3’-OH末端非模板依赖性的dUTPFITC掺入反应。
由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测DNA碎片。
APO-DIRECTKit（Cat.No.6536KK）试剂盒：
PartA（4︒C保存）
PI/RNaseASolutionReactionBufferRinsingBufferWashBuffer
PartB（-20︒C保存）
FITC-dUTP
TdTEnzyme
NegativeControlCells：
已固定细胞PositiveControlCells：
已固定细胞
1.一次性12⨯75mmFalcon试管
2.蒸馏水
3.PBS缓冲液：
含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C保存
4.固定液：
含1%多聚甲醛的PBS缓冲液
5.70%乙醇
6.冰浴箱
7.微量加样器和加样头
8.APO-DIRECTKit试剂盒
9.流式上机检测
1.细胞固定：
（1）用PBS洗细胞后，将细胞重悬于1%多聚甲醛中，浓度为1-2⨯106/ml，冰浴30-60分钟。
（2）300⨯g离心5分钟，弃上清。
（3）用5mlPBS洗细胞两次，重悬于70%乙醇中，浓度为1-2⨯106/ml，冰浴30-60分钟。
（70%乙醇细胞悬液在-20︒C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测，得到的效果最好。
细胞可以在-20︒C保存几个月。
）
2.配制染色液，现用现配。
DNA标记液
1个测试
6个测试
12个测试
ReactionBuffer
10.00μl
60.00μl
120.00μl
0.75μl
4.50μl
9.00μl
8.00μl
48.00μl
96.00μl
蒸馏水
32.00μl
192.00μl
384.00μl
总体积
50.75μl
305.50μl
609.00μl
3.细胞染色：
（1）取离心管和Falcon试管，按标本顺序编号。
（2）取1⨯106细胞悬液加入离心管中，300⨯g离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
质控细胞（NegativeControlCells、PositiveControlCells）：
混匀后取1ml
（细胞数约1⨯106/ml）加入离心管中，300⨯g离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
（3）每管各加入1.0mlWashBuffer，洗细胞两遍，弃上清。
（4）加入染色液50μl，混匀。
（5）37︒C温育60分钟（或者室温过夜），每15分钟摇匀一次。
（非质控细胞
37︒C温育时间需根据不同情况有所凋整。
（6）各管加入1.0mlRinseBuffer，300⨯g离心5分钟，弃上清。
重复两遍，弃去上清。
（7）加入0.5mlPI/RNaseASolution，混匀。
若细胞浓度低，可将用量调整到0.3ml。
（8）室温避光处反应30分钟。
（9）3小时内上流式细胞仪测定结果。
4.结果分析：
PI测定细胞DNA含量，FITC-BrdU测定调亡。
做DNA-W/DNA-A点图和DNA-A/FITC-BrdU点图，进行数据获取。
取单个细胞门（DNA-W/DNA-A设门），分析BrdU直方图，获得细胞凋亡信息。
同时，可分析细胞周期（DNA-A）与细胞凋亡（BrdU）的关系。
5.阴性质控细胞NegativeControlCells和阳性质控细胞PositiveControlCells：
BrdUFlowKits检测细胞增殖
BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，荧光染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
BrdUFlowKits是用BrdU染色和流式分析结合高效的试剂盒，包括在BrdU
升级会员 