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1.3主要仪器
电子分析天平(AE160型,瑞士Mettler公司),手术显微镜(SXP-1B,上海医用光学仪器厂),1411型高频小电刀(上海医疗器械技术公司),低温高速离心机(Sigma公司),光学显微镜(日本OLYMPUS公司),切片扫描仪(蔡司光学仪器),显微图像分析系统(日本尼康公司)。
2实验方法
2.1造模
根据Longa等报道的线栓法建立大鼠永久性脑缺血模型。
10%水合氯醛溶液(0.35mg/kg体质量)腹腔注射麻醉后将大鼠仰位固定,常规碘酒、酒精消毒颈部皮肤。
颈部正中作约2.5cm切口,暴露左侧颈动脉三角,在手术显微镜下逐层分离组织,剥离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。
电刀凝闭ECA的分支甲状腺动脉、ECA与ICA之间的枕动脉,结扎游离ECA主干,分离ICA主干至翼腭动脉(PPA),用无损动脉夹分别夹闭CCA、ICA和PPA,用虹膜剪在ECA残端剪一楔形小口,由此插入钓鱼线(直径0.25mm,头端呈直径约0.3mm的圆球形),轻推钓鱼线使之由ECA通过分叉部进入ICA,至大脑中动脉的起点,阻断大脑中动脉的血液供给。
尼龙线插入深度由分叉处计算约18~22mm。
缝合颈部切口,假手术组手术经过与模型组一样,分离出左侧CCA及ECA、ICA,仅结扎ECA。
用缝合线结扎ECA残端,剪断多余栓线,术区使用青霉素粉少许,逐层缝合手术切口。
待清醒后,参照Bedersont等的评分方法,3分者为造模成功。
假手术组手术经过与模型组一样,但只结扎ECA远心端,不插入栓线阻塞血管。
2.2分组与给药将造模成功的大鼠根据神经功能评分均匀分组,分为模型组和补阳还五汤组。
补阳还五汤组大鼠给予补阳还五汤水煎液,给药剂量为1.26g原药材/100g体质量(相当于临床成人日用量的6.3倍),造模后24h立即灌胃,之后每日称大鼠体质量,计算给药量,于一样时间点给药1次;
假手术组和模型组给予等量生理盐水。
连续给药6d,第7日进行神经功能评分并处死取材。
2.3检测方法及观察指标2.3.1神经功能评分参考Bederson等方法,总分10分。
①提鼠尾,观察右前肢表现。
1分:
内收,但不贴身;
2分:
内收,贴于身体;
3分:
内收贴于身体并踡缩;
4分:
大鼠躯体向右侧旋转。
②评价两前肢肌张力:
将动物置于一金属网上,向后轻提鼠尾,观察两侧前肢肌张力。
0分:
两侧前肢紧拉金属网肌力无明显差异者;
右前肢拉金属网但肌力明显弱于左侧;
右前肢不能拉金属网。
③将动物置一光滑平面,观察侧向推挡阻力。
双侧推挡阻力无明显差异;
右侧推挡阻力明显弱于左侧;
右推大鼠时其向右侧倾倒。
④大鼠左眼上睑下垂,左眼分泌物增加者评2分。
以上4项评分相加为最后神经功能评分。
2.3.2大鼠脑梗死体积检测
造模后第7日,将麻醉大鼠断头取全脑后迅速放于-20℃冰箱中冻存15min后,距额极2mm开场,以视穿插水平为中心,间隔2mm做连续冠状切片,每个脑块切5片,迅速投入5mL1%TTC溶液中,置37℃孵箱孵育30min,避光。
正常脑组织染成红色,缺血区呈灰白色。
TTC染色均匀后取出脑组织,放置于盛有4%多聚甲醛液的小瓶内,固定24h,取出后滤纸吸干外表水分,用扫描仪扫出图片,计算梗死体积占大脑半球体积的百分比。
2.3.3大鼠脑组织及微血管的形态观察
造模后第7日,大鼠灌注后断头取脑,置于4℃、4%中性多聚甲醛固定液(pH7.2~7.6)固定24h后,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,于视穿插前缘开场作5m厚冠状切片。
常规脱蜡水化,行HE染色,中性树胶封片。
光镜下观察脑组织及微血管形态学改变。
2.3.4大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基
质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子的含量测定造模后第7日,将动物麻醉,自腹主动脉采血,静置30min后离心取上清冻存备用。
再取脑分离出左侧(患侧)半球放于冻存管置液氮中,检测前以生理盐水制成10%脑组织匀浆。
取制备好的血清及脑组织匀浆,根据试剂盒讲明操作。
3统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。
实验结果均以xs表示,数据资料经正态性分布检验及方差齐性检验后,采用方差或非参数检验比拟组间差异。
P0.05表示差异有统计意义。
4结果
4.1补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响
动物清醒后,模型组和补阳还五汤组都存在明显神经功能缺损,神经功能评分差异无统计学意义(P假手术组未见神经功能缺损。
灌胃6d后,模型组神经功能评分略增高,但前后比拟差异无统计学意义(P补阳还五汤组神经功能评分显著降低,与模型组比拟差异有统计学意义(P0.01),提示补阳还五汤能够促进大鼠的神经功能恢复,减轻缺损程度。
各组大鼠神经功能评分。
4.2补阳还五汤对大鼠脑梗死体积的影响
TTC染色结果表明,假手术组脑片均红染,无白色梗死灶构成。
模型组大鼠梗死灶位于缺血侧脑组织基底节区和额顶部外侧皮层,脑梗死灶明显。
补阳还五汤组脑梗死体积显著减小,与模型组比拟差异有统计学意义(P0.05)。
4.3病理观察结果
假手术组大鼠脑组织构造完好,灰白质边界清楚,皮质各层细胞分布基本正常;
神经元排列整洁且形态多样,胞核较大、居中、着色浅、核仁明晰、胞质深染;
脑微血管内皮细胞构造完好、连接严密,未见炎细胞浸润、充血及水肿。
模型组脑组织可见梗死灶,灶内构造疏松,呈水肿样,神经元丢失明显,残存的神经元细胞核固缩、浓染;
脑微血管内皮细胞受损,可见炎细胞浸润,嵌塞。
补阳还五汤组脑组织病理变化较模型组减轻,梗死灶体积较模型组缩小,水肿情况减轻;
存活的神经元数目有所增加,血管内皮细胞受损较模型组减轻,有少量炎性细胞浸润;
半暗区损伤亦有所改善。
4.4补阳还五汤对大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子含量的影响
与假手术组比拟,模型组VEGF、MMP-2、MMP-9及vWF含量显著增加(P0.01,P与模型组比拟,补阳还五汤组VEGF、vWF、MMP-9及MMP-2含量显著降低(P0.01,P0.001)。
提示脑缺血7d后,模型组脑组织中VEGF、MMP-2、MMP-9及血清中vWF均增高,补阳还五汤能阻抑其表达。
5讨论
当代研究表明,补阳还五汤可加强微血管应激能力,缓解微血管痉挛,减轻其损伤程度,使微血管密度及微血管面积比增加,减轻缺血损伤。
本实验结果表明,给永久性脑缺血动物补阳还五汤后,神经功能缺损明显改善,脑梗死体积显著减小。
血脑屏障毁坏可导致血管源性脑水肿和脑疝的发生,造成病情的恶化。
故减轻缺血对血脑屏障造成的损伤,保护脑组织,成为治疗的一个重要靶点。
脑组织中细胞外基质(ECM)是维持血脑屏障构造完好性的重要组成部分,而MMPs激活后能够降解ECM成分。
MMPs是一组Zn2+、Ca2+依靠性的蛋白水解酶,正常时以酶原形式存在,在一些生理和病理条件下被激活,介入组织的损伤和修复。
在脑缺血损伤中起重要作用的是MMP-2和MMP-9,可降解ECM、毁坏脑血管外基底膜主要成分,进而毁坏血脑屏障、改变毛细血管通透性导致血管源性脑水肿甚至出血性转化,还可使炎性细胞浸润至脑组织,引发一系列炎症反响。
脑缺血后MMP-2表达增加与早期神经元的损伤有关,MMP-9表达增加与脑梗死后出血转化有关。
MMP-9水平的上升出如今缺血性脑卒中早期或急性期,导致血脑屏障的毁坏,进一步促使神经炎症反响和神经细胞的继发性死亡。
HigashidaJ等研究发现,通过提高缺氧诱导因子-1(HIF-1)、水通道蛋白4(AQP4)、MMP-9的表达能够降低血管基底膜蛋白表达和严密连接蛋白的表达,加重脑水肿,通过抑制HIF-1、MMP-9的表达,降低血脑屏障的通透性,但不受AQP4的影响。
Romanic等[6]则发现应用MMP-9单克隆抗体,梗死灶缩小了29.9%。
因而我们揣测,早期选择性抑制MMP-2、MMP-9可显著减轻脑梗死。
本实验采用酶联免疫法检测了脑组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达情况,在假手术组仅有少量表达,与文献报道基本一致[9-10],脑缺血后MMP-2、MMP-9蛋白表达量显著增加,应用补阳还五汤干涉后,二者水平均显著下降,提示补阳还五汤能够通过抑制MMP-2、MMP-9表达,保护血脑屏障,减轻脑损伤。
内皮细胞是构成血脑屏障的主要物质基础。
循环中的vWF主要来自血管内皮细胞,内皮细胞受损则合成和释放vWF增加,内皮细胞损伤越严重,则血浆中vWF水平越高。
vWF可加速血小板黏附、聚集,介导血小板释放相关因子,干扰纤溶经过,促进血管平滑纤维化、动脉粥样斑块及血栓构成,且与疾病的轻重呈正相关。
因而,vWF被以为是心血管疾病的一个高危因素,并被作为血管内皮细胞损害的标志物。
本实验脑缺血后大鼠血清中vWF表达增高,补阳还五汤显著减少了其表达,讲明补阳还五汤能够保护内皮细胞,进而维持血脑屏障构造的完好性。
VEGF是另一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子,是内皮细胞特异性的促有丝分裂源,能促进内皮细胞分裂、增殖增生和转移,它在血管生成的各个阶段均发挥着重要作用,是目前公认的血管新生中最关键的因子。
本实验假手术组VEGF有少量表达,模型组VEGF表达量增高,这可能是缺血性脑损伤诱导VEGF基因早期表达的缘故;
应用补阳还五汤干涉后,VEGF显著降低,笔者以为,这可能和VEGF的动态表达有关。
因而,能够揣测,补阳还五汤可通太多环节调节VEGF,保护血脑屏障。
目前,西医治疗脑缺血及其后遗症尚无突破性进展,而中医药防治脑缺血具有很大潜力。
本实验显示,补阳还五汤能改善神经功能缺损,减少脑梗死体积,其发挥作用的机理可能是通过抑制MMP-9、MMP-2、vWF的表达而保护血脑屏障,可以能是通过调控VEGF、vWF等内皮活性因子,改善微循环,促进脑血流的恢复。
谈不同比例士的宁对马钱子碱体外经皮浸透性质的影响
马钱子又名番木鳖,为马钱科马钱属植物马钱(Strychnosnux-vomicaL.)或云南马钱(S.pierrianaA.W.Hill)的枯燥成熟种子,主要有效成分为生物碱类。
包括士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物、马钱子碱氮氧化物、异马钱子碱、伪马钱子碱等,约占总量1%-5%。
其中士的宁和马钱子碱约占总生物碱的70%。
马钱子生物碱作用于免疫、神经、心血管等系统,具有抗炎及免疫、镇痛、抗肿瘤等显著疗效。
主要有效成分马钱子碱具有很强的抗炎镇痛和关节炎滑膜细胞增殖抑制作用,而士的宁在抗炎镇痛方面活性较差,且毒性较强,其口服中毒量是马钱子碱的1/71。
因而马钱子制剂中士的宁的含量会直接影响制剂的药效及毒性。
研究表明,马钱子制成经皮给药制剂对风湿痹症等具有较好疗效,但其毒性,尤其是士的宁是亟待解决的问题之一。
为到达治疗的增效减毒,本实验利用体外经皮扩散方法,讨论士的宁与马钱子碱在不同比例下,马钱子碱的经皮扩散行为,为马钱子的炮制及其经皮制剂的研究等应用方面提供参考根据。
材料
1.动物
清洁级雄性ICR小鼠30只,体质量(20.03.0)g,浙江省实验动物中心提供,合格证号: