层析分离方法116页word资料Word文档格式.docx
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（1）非极性的成分常选择氧化铝或硅胶吸附层析；
（2）极性较大则采用分配层析或弱吸附剂吸附层析；
（3）酸性、两性成分可用离子交换层析，有时也可用吸附层析及分配层析。
■各类化合物适宜的层析方法：
a.一般生物碱的分离可用硅胶或氧化铝层析，对极性较高的生物碱也可用分配层析，而对季胺型水溶性生物碱也可用分配层析或离子交换层析。
b.甙类的层析分离往往决定于甙元的性质，如皂甙、强心甙，一般可用分配层析或硅胶吸附层析。
c.芳香油、甾体、萜类（结合成甙除外）包括萜类内酯，往往首选氧化铝及硅胶层析，若在氧化铝柱上有次级反应，则宜用硅胶吸附层析。
d.黄酮体、单宁等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附层析。
e.有机酸、氨基酸一般可选用离子交换层析，有时也用分配层析，有些氨基酸也可用活性炭吸附层析。
f.多肽、多糖等大分子化合物，常用凝胶层析、亲和层析、反相硅胶（键合硅胶）。
第一部分柱层析
第一章硅胶层析
一、层析用硅胶
层析用硅胶一般以SiO2·
xH2O表示，系多孔性的硅氧环Siloxane（a）交链结构，由于其骨架
表面具有很多硅醇Silanol（b）基团，能吸着多量水分，此种水分几乎成游离状态存在，因此当加热至100℃左右能可逆地被除去。
硅胶的活性水分含量有关（见表7-1），
表7-1氧化铝和硅胶含水量与活性的比较
硅胶加入水量（%）
活性
氧化铝加入水量（%）
I
5
II
3
15
III
6
25
IV
10
38
含水量高则吸附力减弱，当游离水含量高达17%以上，吸附能力降低，而可作为分配层析载体。
硅胶于500℃加热能不可逆地失去结合水（一般170℃以上即有少量结合水失去），从硅醇结构变成硅氧环结构，若加热至1,100℃则结合水尽失。
由于硅胶的吸附能力主要与硅羟基数量有关，因此加热温度过高吸附能力反而降低。
有时硅胶层析具有吸附层析与分配层析的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用。
层析硅胶应是中性无色颗粒，但是由于制作过程常可带有酸性，如果酸性不强于pH5，一般已可使用。
■商品层析硅胶合格的判定
a.PH值－一般先检查其是否中性。
取硅胶一份混悬于100份水中放置，应得澄清的中性溶液。
如滤液为酸性，应水洗至中性，再行活化处理。
b.铁离子的检查－一般将硅胶混悬于盐酸中，搅拌，如含铁离子则与盐酸结合成复合物而显黄色。
有铁离子存在即预示有其他金属盐存在的可能性，因此最好以盐酸洗涤处理。
在特殊情况下，硅胶须经乙醚、氯仿等有机溶剂预洗，至洗出液蒸干无残渣为止。
由于硅胶容易吸水，因此用前最好经120℃烘24小时活化，可不作活性测定。
■硅胶的改良：
向层析硅胶中加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果，称改良吸附剂。
例如以硝酸银处理的硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。
以1~10%复合试剂的水或丙酮溶液，与硅胶混匀，待稍干后于110℃干燥即可。
表7-2常用改良吸附剂
复合试剂
选择性分离物
0.1~0.5N酸或碱
pH敏感物质（生物碱、酸性、酚性、两性物质）
AgNO3
具有双键或三键物质
硼酸、硼酸钠、碱式醋酸铅
多羟基化合物
亚硫酸钠
醛类
氯化铁
羟基喹啉类
硫酸铜
胺类
铁氰化锌
磺胺类
二、硅胶吸附层析的应用
■硅胶层析的优、缺点：
优点：
（1）有些化合物用氧化铝层析，吸附剂副反应较多，而且某些副反应即使用中性氧化铝仍难以避免。
而硅胶作吸附剂虽也有个别发生异构化，但一般副反应较少；
（2）某些酸性、酚性物质、色素等易与氧化铝结合而不宜使用氧化铝层析，硅胶则无此特性；
（3）氧化铝层析样品损失较多，而硅胶层析样品回收率较高。
缺点：
（1）即分离效果有时较氧化铝为差，对杂质的吸附能力差；
（2）样品处理量相应的比氧化铝为低。
■硅胶吸附层析的操作
快速层析（FlashChromatography）――既快速简便，又有相当分离效果。
注；
玻璃磨口连接处用弹簧或橡皮圈扣紧。
橡皮管连接处一般在压力为1kg/cm2以下不会脱开。
■操作步骤
1．装柱
A.干法
向层析柱中加入0.5~1cmn高的硅胶H（100～200mesh/目），再将硅胶H（300～400mesh左右，即38m（10~40m））装入柱，敲紧或在出口处抽真空吸紧，使硅胶层高约18～20cm，硅胶层面应水平，上部再加0.5～1cm高的纯净砂层或滤纸。
然后加入洗脱用的溶剂，加压赶去硅胶内气泡，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约15～17cm。
B.湿法
b1.即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌待空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中。
最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段，容易影响分离效果。
b2.向硅胶中加入一定体积的溶剂，充分搅匀，加入到预先装有一定体积溶剂的层析柱内（已加粗硅胶H），同时打开活塞放出溶剂，硅胶下降。
加压赶去硅胶内气泡，至层高约18～20cm，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约15～17cm。
2.硅胶柱内包含溶剂体积的确定（干法）――取一定体积V0的溶剂，加压至砂板处，将层析柱的活塞稍打开，使溶剂滴入接受器中，当氧化铝柱上面的溶剂液面刚好降至填料表面，关闭活塞，量取接受器内溶剂量V1。
则V0V1即氧化铝柱内包含溶剂的体积V。
依据V，在层析过程中，可知在什么时候开始收集流份。
当变换溶剂的时候，就可知道新换溶剂大致在何流份开始。
3.加样
用尽量少的溶剂溶解样品，然后加至柱中，加压压入硅胶层。
难溶样品拌入少量硅胶再装入，上面再复以砂层。
4.洗脱
根据薄层层析资料的判断，用在硅胶薄层板上欲分点为Rf=0.2～0.3的展开溶剂洗脱，如有多点需分离时，可以改变洗脱溶剂的比例。
用减压阀控制压力以调节洗脱速度，收集馏分。
而且为了尽量减少被分离化合物在层析柱中扩散，层析过程中不能有间歇。
5.样品收集
每一馏分用薄层板点样分析，每块薄层板上可点数个馏分点，用原料做对照，前一块板的最后一点应用于下一块板的第一点做对照点。
将相同位置点的馏分合并，蒸除溶剂。
柱的粗细和进样量等的关系（表1）
这时施加的压力约0.4～0.7kg/cm2（可用压力表指示）。
为了达到最好分离效果，使用者可根据具体样品摸索条件。
表1
柱内径（mm）
硅胶用量（g）
加样量（g）
流速（ml/min）
每一馏分体积（ml）
1417253552
10163570150
0.20.51～248
510152030
2.5481525
例：
1.2g原料反应5d后，用硅胶薄层层析显示（展开剂：
石油醚/乙酸乙酯82），主要为二个斑点：
Rf分别为0.23和0.14，相应于未反应原料和产物。
用快速层析法分离（柱内径25mm，青岛海洋化工厂硅胶H35g，硅胶层加压后高17cm）。
先用120ml石油醚/乙酸乙酯（82）洗脱，再用400ml石油醚/乙酸乙酯（82）洗脱。
加压力0.7kg/cm2，流速0.5ml/min。
开始80ml未收集，以后收集15ml左右为一馏分。
馏分1～7：
0.01g，低极性物；
馏分8～15：
0.49g，相应于Rf0.23的原料；
馏分16～18：
交叉馏分；
馏分19～34:
0.37g相应于Rf0.14的产物。
收集时间约1.5h。
总之，此层析法可用于Rf差0.05到0.1的组分分离，一般在2h左右可分离一个样品，既达到一般柱层析的分离效果，又节省了时间，而且溶剂和硅胶用量也可减少。
对不太稳定的化合物，用此法分离尤为适用。
吸附柱层析硅胶的用量――样品与吸附剂的比例可为130～60，但必须根据分离工作的难度，较难分离者有时甚至可选用1500～1000。
硅胶吸附层析适用范围――使用比较广泛，能用于非极性化合物，也能用于极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。
三、硅胶的再生
1.由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单，一般可用乙醇或甲醇洗涤，或于索氏提取器连续抽提除去杂质，洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。
2.硅胶的再生也可用5～10倍体积的1﹪氢氧化钠煮沸半小时，如仍不成强碱性（以酚酞作指示剂），可追加适量1﹪氢氧化钠，趁热过滤，以蒸馏水洗三次，冉以3～6倍5﹪盐酸煮沸半小时，以蒸馏水洗至中性，120℃活化，过筛即得。
四、分配层析的原理及操作
一种溶质在两种不相互溶的溶剂中振摇，当达到平衡时，溶质在两层中浓度都有恒定的比例，这一比值称作该物质在这两种溶剂中的分配系数。
如果需要分离的两种物质，在两相中的分配系数比较接近，则须利用不断地进行反复分配，如使用逆流分溶及分配层析才能达到目的。
1．分配层析的原理――分配层析是以一种多孔物质吸着一种极性溶剂，此极性溶剂在层析过程中始终固定在支持剂上，因此称为固定相。
另用一非极性溶剂（与固定相不相互溶）洗脱，此洗脱剂在层析过程中始终是移动的，称为移动相。
溶质在固定相和移动相之间，在柱上作连续的、动态的不断分配，由于不同成分在两相间分配系数的差异而得以分开。
2.影响分离效果片的因素――两者的分配系数差值。
如果相差较大，只要用较小的柱和较少的硅胶用量即能满意地分离，如果分配系数差值极小，则同样重量的样品往往要用较大的柱和用较多的硅胶才能分开。
3.分配层析所用多孔支持剂――主要有硅胶、硅藻土（商品名Celite）、纤维粉等，近年来并有用有机支持剂的，如微孔聚乙烯粉等。
■操作――分配层析所用的仪器操作一般与吸附层析相同，将预先选定的固定相溶剂（一般为水溶液或极性溶剂）加入支持剂硅胶中，搅拌混合均匀，倾入事先选定的移动相溶剂中，激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡。
层析管中放移动相（事先务必用固定相溶剂剧烈振摇，互相饱和，以造成层析时稳定的平衡条件），将上述吸着固定相的硅胶湿法装柱，不断轻敲管壁或加压，使固定相支持剂压紧。
样品一般可溶于移动相中上柱，继以移动相洗脱，按固定体积收集，分别浓缩处理。
■分配层析操作注意事项：
（1）移动相体积常大于固定相5～l0倍，即相当于以5～10倍体积的有机溶剂向水溶液萃取，而分配系数的含意为溶质在两相中的浓度比，若体
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