结构测定大分子结构 X射线课件PPT格式课件下载.ppt

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,同源的两种含义：

Homology：

两条多肽链相应位点的氨基酸不同，但是尺寸、疏水性等化学性质类似；

（positive）Identity：

两条多肽链相应位置的氨基酸完全相同。

根据序列查找同源结构,BLAST!

http:

/www.ncbi.nlm.nih.gov/输入序列，BLAST根据序列查找目前的数据库中已有蛋白与输入序列的同源程度。

同源度越高，成功可能性越大。

分子置换法的原理,确定了待测晶体（B）的空间群后，利用同源的模型（A）设法找到B中分子在晶胞中的位置（x、y、z）和取向（a、b、g），从而得到B的结构模型，初始相位就可获得。

先旋转，后平移。

旋转,平移,旋转问题：

旋转函数,旋转函数定义为：

PA为晶体A的Patterson函数，U为晶体A的Patterson矢量所在的球形区域。

C为a、b、g三个角度所定义的旋转变换矩阵。

PB,R为晶体B的patterson函数经C变换后得到的函数。

如果旋转晶体，其Patterson函数也以同样的方式选转：

即矩阵C作用于Patterson函数P（u）得到旋转Patterson函数PR（u）。

旋转函数就是PA和PB,R在U空间的相关函数。

如果晶体A里的分子和晶体B里的分子类似，那么旋转到两个分子重叠时，旋转函数有极大值。

Rotationfunction,旋转函数,计算旋转函数注意的事项,低分辨的衍射数据通常不用，这部分数据对旋转不敏感，而且由于溶剂散射的影响，其精度可能较差。

高分辨的数据也不能用，这部分数据对旋转太敏感，误差也大。

合适的分辨率范围是310A。

有时需要尝试不同的分辨率范围。

积分区域：

通常选为球形，其半径通常等于或小于分子的直径。

有时也需要尝试。

模型选取：

易变性较强的氨基酸残基（通过同源蛋白氨基酸残基序列比较，可以确定残基的保守性和易变性）通常不要；

溶剂分子不要；

温度因子都选为一个合适的值；

有时需要人工构建一个P1晶胞以消除分子间原子矢量的影响。

平移函数,确定了旋转的角度abg后，把旋转后的模型分子在（待测）晶胞内作可能的平移，计算不同平移下F的相关因子（correlationcoefficient）：

标准的线性相关因子（standardlinearcorrelationcoefficient）C为：

当模型分子与待测分子重合时，相关因子有极大值。

MR的例子,来源于拟南芥（A.thaliana）的乙酰羟酸合成酶AHAS（EC2.2.2.6，acetohydroxyacidsynthase，过去曾被称为ALS，现在则统称为AHAS）结构。

衍射数据取到3.0A。

模型用来源于酵母的AHAS结构。

这是一个二聚体，从PDB数据里提出一个单体作为模型，去掉水分子。

PDB数据库,ProteinDataBank（PDB）收集了目前解析出来的蛋白质结构；

/www.rcsb.org/pdbBLAST找到同源蛋白后，可以到PDB里下载结构。

同CCP4软件包进行分子置换法。

用CNS也可以。

注意：

由于目前解析生物大分子结构的软件有很多，各个软件的文件格式不同，因此格式转换很繁琐。

例如用HKL2000作数据处理得到的强度文件需要转换为二进制文件。

CCP4软件包里有很多程序就是转换用的。

解析结构也需要在不同软件之间反复切换使用。

第一步：

准备数据,原始数据是用HKL2000（DENZO/SCALEPACK）得到的SCA文件；

用CCP4转换成MTZ文件。

SCA文件记录的是衍射强度，转换为衍射振幅记录在MTZ文件中。

具体步骤

（1）,数据：

atahas_94827.sca注意设置好工作目录：

CCP4中的选项Directories&

ProjectDir。

CCP4/DataReduction/ImportScaledData。

Jobtitle：

可以不填；

分子置换法不用反常衍射，所以不选Useanomalousdata。

具体步骤

（2）,InProject：

输入sca文件（用Browse）。

OutProject自动生成mtz文件名。

可以改变文件的位置（FullpathProject/TEMPORARY）。

必须输入datasetname：

atahas。

输入Estimatednumberofresidualsintheasymmetricunit：

585。

总之，有颜色的地方都要填上，其他的可以不管。

Run！

文件

（1）,用View按钮可以察看文件内容。

SCA文件：

1datanumber,usually1-985batchnumber,nomeaning178.468178.468184.94890.00090.000120.000p6422cell005717093.11706.4h,k,l,I006023413.82159.60063109.4917.8SCA文件纪录了衍射点的强度。

没有反常衍射，所以文件没有纪录I+，I-，只有I。

文件

（2）,MTZ文件：

二进制文件。

有以下内容：

H，K，L，F_atahas，SIGF_atahas，IMEAN_atahas，SIGIMEAN_atahas，FreeR_flag。

这个文件还没有相位信息。

看看ViewFilesfromJob的内容。

第二步：

看看晶体里有什么？

溶剂含量，不对称单位中有几个分子，是否存在非晶体学对称性等。

决定下一步解析的策略。

具体步骤,MolecularReplacement/CellContentAnalysis输入mtz文件：

atahas_94827.mtz。

输入分子量（585x110=64350）。

RUN！

结果解释,Cellvolume:

5101535.000Forestimatedproteinmolecularweight64350Nmol/asymMatthewsCoeff%solvent16.681.223.362.5（比较可能）32.243.741.724.951.36.2,第三步：

找模型,MolecularReplacement/MolrepAutoMR自动化的分子置换法。

搜索模型：

同源结构，可能需要CNS转换一下从PDB下载的文件（CNS：

generate_easy）。

具体步骤,Molrep中输入：

mtz文件，pdb文件注意检查mtz文件中的对称群是否正确。

如果一个不对称单位中有1个以上的分子，需要做自旋转函数，判断是否存在非晶体学对称性，甚至整个晶体的点群可能要重新考虑。

输出文件为搜索得到的模型（pdb文件）。

很不幸，假设晶体的不对称单位含有2个分子搜索失败。

假设不对称单位含有1个分子搜索成功。

Molrep的解,旋转解Sol_RF1106.94-156.09176.1130.56145.90162.7584.378.99Sol_RF2101.98-166.34177.3719.97155.89172.6442.164.49Sol_RF335.5652.11163.5342.0370.27117.8041.324.40Sol_RF435.6447.83163.1337.4970.40121.8336.803.92Sol_RF577.1980.00125.4713.27120.1833.2836.203.86Sol_RF6135.42-178.61120.0140.4174.88217.6335.843.82Sol_RF776.9579.32121.0311.09115.9932.4435.373.77Sol_RF863.3472.32115.5717.7898.2553.1334.703.70Sol_RF937.40108.1738.9033.8423.34357.5034.463.67Sol_RF1014.2850.55147.5433.8327.40112.7333.483.57平移解Sol_TF_1130.56145.90162.750.6000.1560.40188.370.5540.444Sol_TF_1230.56145.90162.750.6000.1560.22245.600.6000.335Sol_TF_1330.56145.90162.750.5990.1560.20144.520.6010.332Sol_TF_1430.56145.90162.750.6000.1560.27443.940.6030.330Sol_TF_1530.56145.90162.750.6000.1560.26342.480.6050.327Sol_TF_1630.56145.90162.750.6000.1560.23741.320.6030.327Sol_TF_1730.56145.90162.750.6000.1560.39040.430.6070.326Sol_TF_1830.56145.90162.750.2670.4890.40138.500.6040.328Sol_TF_1930.56145.90162.750.6000.6560.40127.250.6180.296Sol_TF_11030.56145.90162.750.9290.8200.40321.960.6120.310,第四步：

刚体修正,Refmac5可以修正一些模型的bias。

得到一个初始的pdb文件。

里面包含了初始模型。

（当然模型里的分子不是待测蛋白，而是模型蛋白）。

输出的mtz文件包含了初始相位。

第五步：

消除模型bias,利用resolve的prime-and-search功能。

Resolve软件可以完成多个功能，其中消除模型bias的prime-and-search可以利用。

可以看到模型的误差R因子越来越小。

同晶差值傅立叶法和分子置换法都要求有一个类似的结构作为参考。

但是很多情况下找不到类似的结构（全新结构，denuovo）。

即使认为是有类似结构的条件下，利用这两种方法解析结构不一定能够成功。

这种情况下需要利用同晶置换法和反常散射法：

（间接）测量相位。

IsomorphousReplacement：

同晶置换法,假如能够在蛋白质晶体中加入一些重原子，而不引起晶体结构（或者蛋白质分子结构）的变化（近似，一般会有变化，但是变化很小），那么可以根据加入重金属后衍射强度的