第六章 生物合成技术文档格式.docx

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转化过程所用的受体细胞一般就是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶与甲基化酶的突变株。

受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过感受态细胞。

在一定条件下,将外源DNA分子与感受态细胞混合保温,使外源DNA分子进入受体细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体。

本实验以E、coliDH5α菌株为受体细胞,用氯化钙处理受体菌使其处于感受态,然后在一定条件下与pBR322质粒携带有抗氨苄青霉素与抗四环素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌也具有抗氨苄青霉素与抗四环素的特性,常用Ampr,Tetr符号表示。

将经过转化后的全部受体细胞经过适当稀释后,在含有氨苄青霉素抗四环素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素与四环素的能力都被杀死,所有带有抗药基因的质粒DNA能使受体菌从对抗菌素敏感（Amps,Tets）转变为具有抗药性（Ampr,Tetr）,即表明了该质粒具有生物活性。

这种转化活性就是检查质粒DNA生物活性的重要指标。

转化体经过进一步纯化扩增后,再将转入的质粒DNA分离提取出来,可进行重复转化、电泳、电镜观察及做限制性内切酶酶解图谱、分子杂交、DNA测序等实验鉴定。

为提高转化率,实验中要注意以下几个重要因素:

（1）细胞生长状态与密度:

不要用已经过多次转接及贮存在4℃或室温的培养菌液;

细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×

107个左右为最佳（可通过测定培养液A600nm控制）,密度不足或过高均会使转化率下降。

（2）转化的质粒DNA的质量与浓度:

用于转化的质粒DNA应主要就是共价闭环DNA（即cccDNA,又称超螺旋DNA）,转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时则会使转化率下降。

（3）试剂的质量:

所用的试剂,如氯化钙等,应就是高质量的,且最好分装保存于干燥的暗处。

（4）防止杂菌与其它外源DNA的污染:

所有器皿,如离心管、分装用的Eppendorf管等,一定要干净,最好就是新的。

整个实验过程中要注意无菌操作。

氯化钙转化法由Cohen等首创。

其转化率一般能达到每1μg超螺质粒DNA产生5×

106~2×

107个转化体,足以满足常规基因克隆试验的需要。

该法具有简单、快速、稳定、重复性好、菌株适用范围广等优点而被广泛采用。

三、仪器、材料与试剂

材料:

E、coliDH5α受体菌（Amps,Tets）,pBR322质粒

试剂:

含抗菌素的LB平板培养基:

将配好的LB固体培养基高温灭菌20min后,冷却至60℃左右,加入氨苄青霉素与四环素贮存液,使终浓度分别为50μg/mL与12、5μg/mL,摇匀后铺板。

LB液体培养基:

胰蛋白胨10g/L,酵母浸膏5g/L,氯化钠10g/L,用氢氧化钠调节至pH7、5。

120℃高温灭菌20min。

氨苄青霉素与四环素贮存液:

用50%乙醇配制。

0、1mol/L氯化钙溶液:

每100mL溶液中含无水氯化钙1、10g,用无菌重蒸水配制,灭菌处理。

仪器:

恒温摇床、电热恒温培养箱、无菌操作超净台、电热恒温水浴箱、分光光度计、台式离心机、带盖离心管、吸量管或自动加样器、Eppendorf管等。

四、实验内容

1、感受态细胞的制备

（1）从新活化的E、coliDH5α菌平板上挑取一单菌落,接种于3mLLB液体培养基中,37℃振荡培养12h左右至对数生长期。

将该菌悬浮液以1:

100接种量转接于100mLLB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30min测一次A600nm,至A600nm≤0、7停止培养。

（2）培养液转入离心管中,在冰上冷却片刻后,于0~4℃,4000r/min离心10min。

倒出上清培养液,并将离心管倒置在滤纸片上1min,使残留的培养液流尽。

用10mL冰冷的0、1mol/L氯化钙溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~30min。

于0~4℃,4000r/min离心10min。

弃去上清液,加入2mL冰冷的0、1mol/L氯化钙溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后即制成了感受态细胞悬液。

（3）以上制备好的感受态细胞悬液可在冰上放置,24h后直接用于转化实验,也可加入等体积30%灭菌甘油,混匀后,分装于0、5mLEppendorf管中,每管含100~200μL感受态细胞悬液,置于-70℃条件下保存半年至一年。

2、转化

（1）取100μL摇匀后的感受态细胞悬液（如就是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面操作）,加入pBR322质粒DNA溶液2μL（含量不超过50ng,体积不超过10μL）,此管为转化实验组。

同时做两个对照管。

受体菌对照组:

100μL感受态细胞悬液+2μL无菌重蒸水。

质粒DNA对照组:

100μL0、1mol/L氯化钙溶液+2μLpBR322质粒溶液。

（2）将以上各样品轻轻摇匀,冰上放置30min后,于42℃水浴中保温1、5min,然后迅速在冰上冷却3~5min。

（3）上述各管中分别加入100μLLB液体培养基,则总体积为0、2mL,该溶液称为转化反应原液。

混匀,于37℃水浴中温浴45min（欲获得更高的转化率,此步也可恒温摇动培养）,使受体菌恢复正常生长状态,并使转化体产生抗药性（Ampr,Tetr）。

3、稀释与平板培养

（1）将上述经培养的转化反应原液摇匀后,进行梯度稀释,方法见表1、

表1转化反应原液梯度稀释表

试管号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

转化反应原液/mL

原液

0、1

稀释液10、1

稀释液20、1

稀释液30、1

稀释液40、1

稀释液50、1

稀释液60、1

稀释液70、1

稀释液80、1

稀释液90、1

稀释液（LB液体培养基）/mL

0、9

稀释浓度

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

10-10

稀释倍数

101

102

103

104

105

106

107

108

109

1010

（2）分别取适当稀释度的各样品培养液0、1mL,接种于两种（含抗菌素与不含抗菌素）LB平板培养基上,涂匀。

以上各步操作均需在无菌超净台上进行。

（3）待菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿,于37℃恒温培养箱内培养24h,待菌落生长良好而又未相互重叠时停止培养,每组平行做两份。

4、检出转化体与计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数,各实验组平皿内菌落生长情况应如表2所示。

表2各实验组在培养皿内生长情况及结论

不含抗菌素培养基

含抗菌素培养基

结果说明

受体菌对照组

有大量菌落长出

无菌落长出

本实验中未产生抗药性突变株

质粒DNA对照组

pBR322质粒DNA溶液不含杂菌

转化实验组

有菌落长出

pBR322质粒进入受体细胞使其产生抗药性

所以,转化实验组在含抗菌素培养基平皿中长出的菌落即为转化体,根据此皿中菌落数则可计算出转化体总数与转化率,计算公式如下:

再根据受体菌对照组不含抗菌素平皿中检出的菌落数,则可求出转化反应液内受体菌总数,进一步可计算出本实验条件下,由多少个受体菌可获得一个转化体。

五、注意事项

（1）本实验涉及溶液的移取、分装等需敞开实验器皿的操作,均应在无菌超净台中进行,以防污染。

（2）衡量受体菌生长情况的A600nm与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同,因此,不同菌株的合适A600nm就是不同的。

（3）转化菌不宜培养时间过长,使其菌落过多而重叠,妨碍计数与单菌落的挑选。

六、思考题

1、如果一次实验的转化率偏低,应从哪些方面去分析原因？

2、制备感受态细胞的基本原理就是什么？

3、如果在对照组不该长出菌落的平皿中长出了一些菌落,您该怎样分析您的实验结果,并进行下面的实验？

实验2PCR扩增基因特异片段

1、学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则;

2、了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响;

3、掌握PCR的基本操作

PCR（polymerasechainreaction）就是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。

在分子生物学研究中,广泛地应用于研究基因突变,获取加上酶切位点的目的基因与DNA序列测定等方面,就是分子生物学中一项极为常用的技术。

PCR的原理就是在模板DNA、引物与4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。

两个引物分别位于靶序列的两端,同两条模板的3＇端互补,由此限定扩增片段。

PCR反应由一系列的变性—退火—延伸反复循环构成,即在高温下模板双链DNA变性解链,然后在较低的温度下同过量的引物退火,再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。

由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。

理论上,经过N次循环可使特定片段扩增到2n-1,考虑到扩增效率不可能达到100％,实际上要少些,通常经25～30次循环可扩增106倍,这个量足够分子生物学研究的一般要求。

（一）PCR引物设计

1、Tm值Tm值就是PCR引物设计中的一个重要参数,就是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50％的引物与模板配对,而另外50％的引物处于解离状态时的温度,Tm值一般高于55℃。

合适的引物选择应需考虑到以下因素,如Taq酶的最适温度（TE）与Tm值等。

最常用的Taq酶的最适温度（TE）范围为70～74℃,根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围（Ta）。

这个温度范围应不高于酶的最适反应温度,也不能比TE－25℃更低。

这就是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时,酶的合成反应会非常缓慢,但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增。

所以Ta的选择应满足TE-25℃<

Ta<

TE