细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究Word格式文档下载.docx

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李恒,傅振坤,王丽虹,李大林,吴娜,章婕,李殿俊【摘要】　　目的:

探讨CTLA4基因多态性位点1722T/C和CT60G/A与中国北方汉族妇女乳腺癌易感性的关系。

方法:

采用聚合酶链反应（PCR）和限制性片段长度多态性方法,对328例中国北方汉族乳腺癌患者和327例正常对照者进行CTLA4基因1722位点和CT60位点多态性检测。

结果:

乳腺癌患者CTLA4基因CT60位点G等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对照组（28.7%比23.5%;

P=0.0352,OR=1.30,95%CI=1.02～1.67）;

1722CCT60A单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率,有明显差异（P=0.0283,OR=0.77,95%CI=0.97～0.61）,而在1722位点基因型频率、等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义（P0.05）。

结论:

CTLA4基因多态性1722和CT60两个位点与我国北方汉族妇女乳腺癌发病存在一定的相关性。

【关键词】乳腺癌CTLA4基因单核苷酸多态性单体型　　[Abstract]AIM:

ToinvestigatetheassociationbetweentheCTLA4promoter1722（T/C）and3′untranslatedregionCT60（G/A）polymorphismsandtheriskofbreastcancerinHanwomenofnortheastChina.METHODS:

328patientswithbreastcancerand327healthypeopleascontrolweregenotypedfor1722andCT60polymorphismusingpolymerasechainreactionandrestrictionfragmentlengthpolymorphism.RESULTS:

ThefrequencyoftheGalleleattheCT60siteinbreastcancerpatientswasstatisticallyhigherthanthatincontrol（28.7%vs23.5%,P=0.0352,OR=1.30,95%CI=1.02-1.67）.Thefrequencyof1722CCT60Ahaplotypeincontrolwassignificantlyhigherthanthatinbreastcancerpatients（P=0.0283,OR=0.77,95%CI=0.97-0.61）.However,thedistributionofgenotypesat1722sitewasnotsignificantlydifferentbetweenbreastcancerpatientsandcontrol.CONCLUSION:

Thepolymorphismof1722T/CandCT60G/AmayberelatedtothedevelopmentofbreastcancerinHanwomenofnorthernChina.　　[Keywords]breastcancer;

CTLA4gene;

singlenucleotidepolymorphism;

haplotype　　乳腺癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤,其发病机制虽然尚未完全清楚,但是免疫系统在其中的作用已逐渐引起了人们的关注。

有研究表明,乳腺癌患者体内存在免疫系统的抑制性环境,特别是在年轻患者和病情严重患者更为明显,其中T细胞表面的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）分子发挥了重要作用[1]。

人类CTLA4基因定位于2号染色体长臂33带（2q33）,主要表达在活化的T细胞上,它可与抗原提呈细胞表面的B7分子结合并抑制T细胞的增殖与活化[2]。

有研究表明位于CTLA4基因3′端非编码区和基因启动子区的基因变异影响了CTLA4的表达和转录,其中单核苷酸多态性位点CT60显示出了较强的关联性,但并不能排除其他位点的作用[3]。

为了进一步验证上述基因遗传多态性是否与我国北方汉族妇女乳腺癌的发生相关,我们选择了转录本末端CT60G/A位点和基因启动子区的1722T/C位点进行了此次病例的对照研究。

　　1材料和方法　　1.1对象及材料乳腺癌病例为在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院进行手术治疗的患者,共340例,均经组织病理学确诊,术前均未行放射或化学治疗,年龄30～73岁,经患者本人及家属同意的情况下,取空腹外周静脉血。

正常对照组人群外周血由哈尔滨医科大学附属第一医院提供的体检女性获得,共350例,平均年龄为（46.3±

17.0）岁,要求没有癌症家族史,其他详细记录与乳腺癌患者相同。

DNA提取试剂盒购自天为时代公司;

温度梯度DNA扩增仪购自Biometra公司;

TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司;

引物由上海生物工程公司测序。

　　1.2方法　　1.2.1基因组DNA提取抽取肿瘤患者及正常对照个体的外周血5mL,以ACD抗凝,使用DNA提取试剂盒从外周静脉血标本抽提基因组DNA,-20℃保存。

　　1.2.2CTLA4的1722、CT60基因片段扩增采用PCR方法,用温度梯度DNA扩增仪从基因组DNA中扩增CTLA4基因中含有相应位点的基因片段。

PCR反应体系为25μL,其中基因组DNA0.3μg,1×

PCR缓冲液,0.3mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTPs,2UTaqDNA聚合酶,上、下游引物各0.1μmol/L。

PCR反应条件为:

（1）启动子区1722T/C位点PCR引物序列:

上游为5′CTAAGAGCATCCGCTTGCACCT3′;

下游为5′TTGGTGTGATGCACAGAAGCCTTT3′。

PCR扩增条件:

94℃预变性5min;

94℃15s,58℃5s,72℃45s进行30个循环;

最后72℃延伸7min。

PCR扩增片段为486bp。

（2）转录本末端CT60G/A位点PCR引物序列:

上游为5′GAGGTGAAGAACCTGTGTGTTAAA3′;

下游为5′ATAATGCTTCATGAGTCAGCTT3′。

94℃30s,55.6℃30s,72℃30s进行30个循环;

最后72℃延伸5min。

PCR扩增片段为178bp。

　　1.2.3限制性片段长度多态性分析PCR扩增产物分别加入限制性内切酶BbvⅠ和HpyCHⅣ,于37℃水浴16h,20g/L琼脂糖凝胶电泳分离,然后用溴化乙啶染色观察。

　　1.2.4统计学处理采用Arlequin软件进行HardyWeinberg平衡规律计算基因型和等位基因频率,运用统计学软件SPSS和haploview协助对单体型数据进行处理,采用χ2检验和Logistic回归分析计算比数比（oddsratio,OR）及其95%可信区间（confidenceinterval,CI）,以P0.05为有统计学意义。

　　2结果　　2.1CTLA4基因1722、CT60位点多态性酶切结果1722位点PCR扩增片段为486bp,1722位点经限制性内切酶BbvⅠ消化和20g/L琼脂糖凝胶电泳后,基因型T/T纯合子酶切片段为486bp1条带,基因型C/C纯合子酶切片段为270bp和216bp2条带,基因型T/C杂合子酶切片段为486bp、270bp和216bp3条带（图1）。

CT60位点经限制性内切酶HpyCHⅣ消化和20g/L琼脂糖凝胶电泳后,基因型G/G纯合子酶切片段为178bp1条带,基因型A/A纯合子酶切片段为107bp和71bp2条带,基因型A/G杂合子酶切片段为178bp、107bp和71bp3条带（图2）。

　　2.2乳腺癌患者和正常对照组CTLA4基因1722、CT60基因多态性分布经Arlequin软件检验,乳腺患者组和正常对照组CTLA4基因1722、CT60基因型分布符合HardyWeinberg平衡。

CT60位点乳腺癌患者组A/A、A/G、G/G基因型频率与正常对照组比较（表1）,差异无统计学意义（P0.05）,但是G等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对照组（28.7%比23.5%;

P=0.0352,OR=1.30,95%CI=1.02～1.67）。

然而,在1722位点上,乳腺癌患者组T/T、T/C、C/C基因型频率以及T、C等位基因频率与正常对照组比较差别均无统计学意义。

　　图1CTLA4基因含1722T/C位点的PCR产物经BbvⅠ酶切后的电泳图（略）　　Fig1ElectrophoresischartofPCRproductscontaining1722T/CSNPofCTLA4digestedbyBbvⅠ　　M:

DNAmarker;

1:

TT;

2,4:

CC;

3:

TC.　　图2CTLA4基因含CT60G/A位点的PCR产物经HpyCHⅣ酶切后的电泳图（略）　　Fig2ElectrophoresischartofPCRproductscontainingCT60G/ASNPofCTLA4digestedbyHpyCHⅣ　　M:

1,3,5:

AA;

AG;

6:

GG.　　表1乳腺癌患者和正常对照1722T/C、CT60G/A位点基因型及等位基因分布（略）　　Tab1Distributionsofgenotypesandallelesin1722T/CandCT60G/Aofpatientsandcontrols　　2.3乳腺癌患者和正常对照组CTLA4单体型分析CTLA4单体型与乳腺癌相关性的分析应用haploview软件,1722和CT602个位点构成了3个主要的单体型（频率5%）。

其中1722CCT60A单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率,有统计学意义（P=0.0283,OR=0.77,95%CI=0.97～0.61）;

而1722TCT60A和1722TCT60G2个单体型在病例组和对照组中的频率无统计学意义（表2）。

　　表2乳腺癌患者和正常对照1722T/C、CT60G/A位点单体型分析（略）　　Tab2Analysisofhaplotypefrequenciesbetweenallelesof1722T/CandCT60G/A　　3讨论　　乳腺癌的发生和发展过程中细胞介导的免疫反应发挥了重要作用,然而T细胞的活化是一个复杂的过程,受TCR和共刺激信号的精细调节。

作为CD28的同源分子CTLA4也是T细胞表面重要的共刺激分子,并且在T细胞应答的不同阶段都发挥了重要的作用,包括调节T细胞活化的阈值,抑制T细胞增殖,和诱导活化T细胞的