精品水体污染物对淡水贝类抗氧化系统的影响文档格式.docx
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1000ml，2只，容量瓶500ml,100ml各2个；
广口瓶1000，2000ml各2个，匀浆器10ml30支；
移液枪1mL,100µ
L,5mL支各一支。
水浴锅，一台
四、实验内容
内容一、重金属和有机污染物对褶纹冠蚌的胁迫（8课时）
1、仪器\试剂和设备
PH计、量筒、烧杯、滤纸，硫酸锌或硫酸铜、苯酚或联苯胺、水族箱、充氧泵
2、方法
选择壳长为（9.66±
1.07）cm、壳高（6.58±
0.85）cm的健康蚌，在水族箱中暂养一周以上，水温控制在20℃、PH6.8-7.0，保持水中通气（连续冲气暂养），每天换水一次。
将120只褶纹冠蚌随机分成6组，每组24只，其中一组作为对照，不加入其他任何物质，其他5组用于实验，实验组中3组分别加入重金属（铅或锌）使终浓度为2mg/L（高浓度组）、1mg/L（中浓度组）、0.5mg/L（低浓度组），两组加入有机污染物（联苯胺或苯酚）使终浓度为（高浓度组）、低浓度组。
各种缓冲液的配制。
内容二、酶原液的提取（8课时）
注射器，离心管、阿氏液、天平、离心机等
2、血清样品的制备重金属和有机物胁迫后，在0、12、24、48、72、96h分别用2.5mL注射器5号针头从对照组和实验组蚌闭壳肌血窦中取血约1.5mL,每个时间段每组取4只，以3600r／min的转速低温（4℃）离心10min，移出上清液，获得实验所用血清样品，置于4℃冰箱中备用。
3、肝胰脏提取液的制备蚌取血后，取出适量肝胰脏，滤纸吸干水分后称重，加入无菌生理盐水（0.9%）于冰浴中匀浆，使浓度达到0．1g／mL，在4℃条件下，以3000r／min离心l0min，除去沉淀后获得蚌的肝胰脏组织提取液，并以其作为酶原液进行酶活性测定，置于4℃冰箱中备用。
内容三、蛋白浓度的测定考马斯亮蓝G-250比色法（8课时）
1.目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、原理
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。
考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。
它在游离状态下最大吸收波长为464nm。
由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。
当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm。
这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。
该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。
但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。
3、实验材料及设备
（1）材料
褶纹冠蚌肝胰脏提取液
（2）仪器
分光光度计
离心机
电子天平
（3）器材
刻度试管：
25mL×
9
10mL×
1
移液管：
1mL×
3
20mL×
1
烧
杯：
250mL×
2
50mL×
1离心管：
1滴
管：
2
洗耳球：
2坐标纸
研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：
各1
4、试剂的配制
1.牛血清白蛋白（BSA）标准液（100mg/mL）
精确称取10mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2.考马斯亮蓝G-250染色液
取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%的乙醇中，加入100mL85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。
过滤待用。
该试剂于常温下可保存1个月。
5、操作步骤
1.
样品液的制备
按内容2肝胰腺样品制备
2.标准曲线制作及样品测定
取9支试管，按下表所示顺序操作。
6、结果处理
1.由0～5号管的数据，以蛋白质含量（mg）为横坐标，A595为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，标准曲线的相关系数必须达到0.95以上；
2.求样品管A595的平均值A595；
3.由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量（mg）；
4.计算每个样品中蛋白质的含量（单位用mg/g鲜重）。
内容四、CAT活性测定（氮蓝四唑法）（8课时）
1、原理
在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性物质，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2、仪器
荧光灯管、离心机、分光光度计、PH计。
3、试剂
（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·
3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（L-Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA-Na2），以上试剂均为分析纯级；
所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8,5.0×
10-2mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
试剂配制：
（1）：
0.05mol/L的PBS,PH=7.8
（2）130mmol/LL-Met:
1.9399gL-Met用PBS定容至100ml.
（3）750mmol/LNBT:
0.06133g用PBS定容至100ml.（避光保存）
（4）100µ
mol/LEDTA-Na2：
0.03721g用PBS定容至1000ml.
（5）20µ
mol/L核黄素：
0.0753g用蒸馏水定容至1000ml.
4、测定步骤
（1）酶液的制备：
同上，测定血清和肝胰腺的SOD活力。
（2）酶反应酬体系液的制备：
加样顺序：
（V=3ml）磷酸缓冲液：
1.5ml，L-Met
（甲硫氨酸）:
0.3ml,NBT（氮蓝四唑）:
0.3ml,EDTA-Na2,0.3ml,核黄素，0.3ml,酶液，0.05ml,蒸馏水：
0.25ml，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
向每支试管加入25~30μL酶液。
在25~30℃下用光强4000lx的荧光灯管（可用15W荧光灯）进行光照，15~20min后，出现颜色变化。
停止光照。
在560nm波长下比色测量透光度。
用未加酶液的反应体系做对照。
5、结果计算
以抑制蓝色形成的50%为一个酶活单位。
按下式计算：
式中s——样品照光后的透光度；
a——未加酶之反应液照光后透光度；
b——未加酶之反应液照光前透光度；
n——酶液稀释倍数。
样品酶活单位表示：
SOD酶活单位（U）/g干重（g鲜重或g蛋白）。
6.注释
（1）进行照光操作时，应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。
（2）进行比色测定时，应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。
照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值。
2、MDA的测定
5%TCA（三氯乙酸）,5g用蒸馏水定容至500ml.
（2）0.5%TBA（硫代巴比妥酸）:
2.5g用TCA定容至500ml.
方法：
酶液1ml—3ml0.5%TBA混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值
内容五、SOD活性测定（8课时）
1、目的
了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法
掌握简易凝胶层析与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算
过氧化氢酶（Catalase，CAT，EC1.11.1.6）是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除H2O2的重要酶之一，其催化的反应为：
通过上述反应，CAT可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平，减少自由基和过氧化脂质的形成，对生物体起重要的保护作用。
传统测定CAT活力（活性）的方法有滴定法和测压法，但这两种方法不仅误差较大，且比较复杂。
本实验采用紫外分光连续记录测定法，具有操作简单，灵敏度高，结果直观的优点。
测定时，酶反应在紫外分光光度计的石英比色皿中进行，分光光度计与记录仪相连接，由于H2O2在240nm处有吸收峰，加入酶液后会使A240下降，而A240下降的情况又可以记录在纸上，从记录的初始直线段计算A240的变化速率DA240·
min-1，最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出DA240·
min-1·
g-1Fw并以此来表示样品中CAT活力的大小。
1.材料
上述制备的血清和肝胰腺匀浆液
2.仪器
电子天平高速冷冻离心机记录仪紫外分光光度计
3.器材
刻度试管、移液管、微量进样器、塑料离心管、小试管滴管洗耳球、硫酸纸
（1）50mmol/L的PBS（pH7.0）
（2）0.3%H2O2—1mlH2O2定容至100ml
1.粗酶液的制备
略
2．酶活力测定
（1）紫外分光光度计与记录仪相连接，波长定于240nm处，记录仪的量程定于50mV处，预热10min，仪器调零。
（2）以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零
（3）在光径为1cm的石英比色皿内，先加入3mLCAT反应液，再加0.1mL的血清或肝胰腺样品（视酶活力大小而定），用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀数次（不要过分剧烈颠倒）；
立即把石英比色皿插入比色架上，关盖，同时将记录仪的纸速开关拨至4mm/min处，A240的变化情况被记录于纸上。
3min后关闭纸速开关。
（3）重复步骤
（2），再测定1～2次。
1.在记录纸上取实验记录得到的直线一段，计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值，得ΔA240·
min-1，（记录纸的纵轴为时间分钟，横轴为光吸收A240），该余切值代表酶反应的初速度，最后取重复测定的平均值
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