生物技术药物模板文档格式.docx

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①细胞总RNA的提取和mRNA的分离;

②第一条cDNA合成:

oligo（dT）引物引导的DNA合成法、随机引物合成法、特定寡核苷酸引物合成法;

③第二条cDNA合成:

自身引物合成法、置换合成法、外加引物合成法

④双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖

✧限制性核酸内切酶（同尾酶）:

一类能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列并能切割DNA双链的核酸内切酶。

识别序列特点:

多数具有严格的识别序列;

识别序列的长度:

4~8个碱基对;

序列特征:

回文序列

第四讲基因工程基本过程与方法（三）——细胞转化与转染

连接子导入受体细胞:

转化:

将质粒或DNA导入宿主细胞,引起细胞遗传的改变。

转染:

真核细胞的转化

转导:

经过噬菌体（或病毒）将宿主基因从一个细胞转移到另一个不同基因型的细胞中。

※常见方法:

原核细胞:

CaCl2感受态法、噬菌体体外包装法

真核细胞:

电穿孔法、DNA-磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法

✧CaCl2感受态法:

适用于革兰氏阴性细菌。

原理:

是钙离子与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲（HeatShock）发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,使DNA分子能够经过。

优点:

操作方便

缺点:

转化效率较低

重组体克隆的筛选与鉴定:

抗药性标记筛选、※兰-白斑筛选（α-互补）、DNA电泳检测

✧α-互补:

将缺陷α-半乳糖苷酶N端部分序列的质粒载体转入缺陷α-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主菌,而且在含有X-gal的培养基上选择性培养,用乳糖类似物IPTG作为安慰性诱导剂进行诱导。

质粒转入宿主菌后,宿主与质粒产生的有缺陷的α-半乳糖苷酶之间能够形成互补,对X-gal进行降解可产生蓝色菌落,这就是α-互补现象。

定点突变:

1、盒式诱变:

利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。

2、寡核苷酸引物诱变:

指应用合成的寡核苷酸片段作为诱变剂,诱发基因或DNA片段中特定位点发生突变的技术。

3、PCR诱变

寡聚核苷酸介导的突变

盒式突变

PCR介导的突变

优点

保真度高

简单易行

突变效率高

操作简单

突变成功率高

缺点

突变效率相对低

操作复杂

周期长

受到酶切位点的限制

后续工作复杂

TaqDNA聚合酶保真性偏低

第五讲原核表示系统

✧启动子（promotor）:

是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。

✧核糖体结合位点（RBS）:

遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）。

它是起始密码子AUG上游的一段非翻译区序列。

常见的启动子转录调控系统

1、Plac转录调控系统:

弱,IPTG诱导

2、lPL和lPR转录调控系统:

强,热诱导

3、Ptrp转录调控系统:

强,吲哚丙烯酸

4、Ptac转录调控系统:

强,IPTG诱导

5、PT7转录调控系统:

转录活性高,特异性强;

IPTG诱导

表示形式:

蛋白质结构:

非融合型表示:

天然完整蛋白

融合型表示:

如GST融合表示蛋白

1、转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列调控,表示效率较高

2、融合蛋白较天然真核蛋白更稳定

3、能够利用识别原核肽段的配体进行亲和层析纯化

4、融合蛋白分子量大,易于电泳鉴定

表示部位:

包涵体、周质表示

✧包涵体:

存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。

形成原因:

目的基因的高表示,使蛋白无足够时间进行肽链折叠,产生凝集;

种种原因引起的蛋白不能正确折叠;

蛋白的性质;

温度、pH值等环境条件的影响等。

特点:

1.简化外源基因表示产物的分离操作:

2.能在一定程度上保持表示产物的结构稳定

周质分泌表示的特点

1、分泌后的蛋白产物不含氨基端甲硫氨酸

2、原核生物细胞质中的还原环境不利于蛋白二硫键的形成,而氧化性的周质间隙能够模拟真核细胞的内质网环境,便于新生肽链折叠成天然结构,从而获得完全生物活性的重组蛋白

3、一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白在周质中稳定性提高

第六讲真核表示系统

※真核表示载体的主要构件:

1.启动子和增强子、终止信号和poly（A）信号、剪接信号;

2.允许载体在细菌内扩增的序列:

复制起始位点和抗药性标记基因;

3.多克隆位点:

插入外源DNA片段

4.用于筛选出外源基因已整合的选择标记:

a）抗生素抗性基因,如:

neo基因:

使细胞产生对新霉素衍生物G418的抗性。

b）营养缺陷型基因,如:

二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因等等

5.显性活动调控区（dominantcontrolregion,DCR）序列,克服因载体整合在宿主基因组不同位点而产生的表示水平降低。

酿酒酵母作为表示宿主的优缺点

1、安全无毒、不致病;

2、遗传背景清楚,易进行遗传操作;

3、培养条件简单;

4、易进行载体DNA的导入

1、发酵时产生乙醇,乙醇的积累会影响酵母本身生长,较难进行高密度发酵

2、蛋白质的分泌能力较差

3、常发生过度糖基化

毕赤酵母表示系统优缺点

（1）高表示:

表示载体一般利用醇氧化酶基因（AOX1）的启动子,功能很强。

（2）高分泌:

应用啤酒酵母因子的前导序列,有很好的分泌效果,有些蛋白分泌表示可10g/L;

（3）高稳定:

一般用整合型载体YIP,整合于染色体上,构建的转化子菌株十分稳定;

（4）糖基化功能较啤酒酵母更接近高等真核生物。

（1）分子生物学研究基础差,对其进行遗传改造困难较大;

（2）发酵虽能达高密度,但发酵周期较长;

（3）不是一种食品微生物,发酵时又要添加甲醇,因为AOX1启动子是被甲醇调控的,当毕赤酵母以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源时,菌体能够生长,但AOX1启动子是关闭的,当这些碳源耗尽,添加甲醇时,AOX1的mRNA可占总mRNA5%。

昆虫表示系统的优缺点

1、插入较大的外源基因,借助多元表示载体能够同时表示多个外源基因;

2、表示载体一般使用多角体蛋白或p10等强启动子,实现蛋白的超高表示,能够达到细胞总蛋白的25～50%;

3、能有效地进行蛋白质翻译的加工,如糖基化、脂酰化和磷酸化;

4、杆状病毒有严格的宿主细胞专一性,对脊椎动物和植物即不能感染也不能在非宿主细胞中繁殖或发生整合,因此十分安全。

1、不能连续合成重组蛋白,因为昆虫细胞感染病毒后4～5天后就死亡,无法继续表示蛋白;

2、多角体蛋白及p10启动子控制的基因表示是在感染的晚期,因此表示产物的翻译后加工可能是不完全的;

3、费用昂贵,当前培养昆虫细胞需加胎牛血清,特别是在大规模悬浮培养时更增加了生产成本。

重组病毒获得:

了解大框架

第七讲植物基因工程

✧植物基因工程抗体:

是利用基因工程技术在植物中表示生产的抗体,即将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物,在植物中表示出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段。

农杆菌载体系统:

农杆菌是一种天然的植物遗传转化系统。

根癌农杆菌和发根农杆菌是土壤中的植物病原菌,能感染大多数双子叶植物的受伤部位,分别诱导冠瘿瘤和发状根。

冠瘿瘤和发状根分别由根癌农杆菌中的Ti质粒和发根农杆菌中的Ri质粒引起

农杆菌转化植物体的方法

1.叶盘法:

将叶圆片放入农杆菌菌液一段时间,然后转移到培养基上,使转化细胞再生植株;

2.整株感染法:

用农杆菌感染植株创伤部位,然后无菌培养癌瘤组织,从愈伤组织分化出转基因植株;

3.共培养法:

将原生体（去细胞壁的植物细胞）与农杆菌一起培养,离心去菌,在选择培养基上得到转化细胞系,最后再生得到转基因植株

第八讲蛋白质分离纯化

⏹蛋白质浓度测定:

常见的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种

凝胶过滤层析（分子筛层析）:

凝胶是具有网孔结构的颗粒,当分子大小不同的蛋白质混合液流经凝胶装成的层析柱时,比凝胶网孔小的蛋白质分子进入网孔内,比凝胶网孔大的蛋白质被排阻在外,当用溶剂洗脱时,大分子先被洗脱,小分子后被洗脱

亲和层析:

是利用蛋白质分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲合力而得以分离纯化的技术。

原理①亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为吸附剂。

②当含有混合组分的样品经过时,只有与该分子有特异亲合力的物质才能被吸附结合,其它没有亲合力的无关组分随缓冲液流出。

③改变缓冲液组分,将结合的亲和物洗脱下来

离子交换层析:

利用离子交换树脂作为支持物,将带有不同电荷的蛋白进行分离的方法。

分类:

阳离子交换树脂、阴离子交换树脂。

经过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化目的。

第九讲干扰素和白细胞介素

✧干扰素:

是由病毒和其它种类的诱导剂,刺激巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一组复杂的蛋白质。

这类蛋白具有多种生物活性,包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。

⏹干扰素的生物学活性:

1、抗病毒（I型）:

诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白,干扰病毒复制;

增强NK细胞对病毒感染细胞杀伤;

促进MHC-I类分子表示,增强CTL的杀伤能力

2、抗肿瘤（I型和Ⅱ型）:

Ⅰ型:

抑制肿瘤病毒的繁殖;

抑制细胞增生、诱导分化、促进凋亡;

增强NK细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞杀伤;

Ⅱ型:

增强机体免疫机制、加强免疫监督功能

3、免疫调节作用（Ⅱ型）:

活化巨噬细胞;

促MHC-II类分子表示,提高APC抗原递呈能力;

促MHC-I类分子表示,增强NK和CTL杀伤活性;

调节T细胞和B细胞功能;

抑制Th2细胞分化及细胞因子合成

✧白细胞介素（Interleukins,ILs）:

是一类由免疫细胞（淋巴细胞、单核巨噬细胞等）和相关细胞（成纤维细胞、内皮细胞等）产生的高活性多功能的低分子量分泌蛋白。

⏹白细胞介素的生物活性:

1、免疫调节活