植物愈伤组织诱导培养实验指导李老师Word文档格式.docx

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3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具

分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、

1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。

3.2试剂

（1）95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。

（2）MS培养基成分：

1大量元素（母液I）:

NHNO、KNOCaCb2H2OMgSO7mOKHPO;

2微量元素（母液口）:

KI、HBQMnSQ4H2OZnSQ.7H2ONQM0Q.2H2OCuSQ5H2OC0CI2.6H2Q；

③铁盐（母液川）:

FeSQ.7H2QNQ.EDTA.2H2Q；

④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：

肌醇、盐酸吡哆醇（维生素&

）、烟酸（Vpp）、盐酸硫胺素（维生素Bi）、甘氨酸；

（3）植物生长调节物质：

2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）o

4、操作步骤

（1）MS大量元素母液的配制

按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表1中的次序

分别准确称量后，分别用50ml烧杯，加入蒸馏水30ml溶解（可以加热至60C〜70C,促其溶解）。

溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备

用。

表1MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量

母液

化合物名

称

培养基

用量

（mg/L

）

扩大

倍数

称取量

（mg）

母液体积

（mL）

1L培养

基吸取母

液量

大量

KN03

1,900

10

4,750

250

100

NH4NO3

1,650

4,125

MgSO47

H2O

370

9,25

丿兀素

KH2PO4

70

425

CaCI22H

2O

440

1,100

（2）微量兀素母液的配制

按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100

倍（表2），用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、

配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

表2MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量

化合物名称

培养基用量

（mg/L）

扩大倍

数

母液体

积（mL）

1L培养基吸

取母液量

微

MnSO44H2O

22.3

223

量

ZnSO47H2O

8.6

86

元

H3BO3

6.2

62

素

KI

0.83

8.3

Na2MoO42H2

O

0.25

2.5

CuSO45H2O

0.025

10ml*

C0CI26H2O

10ml**

*、**:

因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取0.25g,

溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。

（3）铁盐母液的配制

常用的铁盐是FeSQ7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。

配制时，按照扩大后的用量（表3）,分别称取FeSq7H2Q和Na?

-EDTA

分别溶解后，将FeSQ溶液缓缓倒入Na?

-EDTA溶液（需加热溶解），搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

表3MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量

培养基用

量（mg/L）

铁盐

Na2-EDTA

37.3

373

FeSO47H2O

27.8

278

（4）有机物母液的配制

按照表4中各成分浓度扩大后的用量，用感量O.OOOIg天平分别称量各

有机物。

可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。

一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用少量稀氨水或1mol/LNaOH溶液溶解；

VH（生物素）先用1mol/LNaOH溶液溶解；

VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

表4MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量

有机物名称

（mg/L）

甘氨酸

2.0

20

有

Vb1

0.4

4

机

Vb6

0.5

5

物

烟酸

肌醇

1,000

（5）激素母液的配制

激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般

是0.1〜2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。

称量激素要用感量为万分

之一天平。

本实验选用激素2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）。

2,4-D母液的配制方法为：

准确称取10mg2,4-D,称量后先用少量（1-3ml）95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml,即得到0.1mg/ml的2,4-D贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

（6）在配制母液时注意事项：

1培养基各试剂应使用分析纯。

2在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。

3母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配

制日期，并存放在4C冰箱中。

使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。

5、结果记录与分析

（1）记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母液中各成分的称取量。

（2）仔细观察在配制母液过程中的现象与遇到的问题，如是否产生浑浊或沉淀，并分析出现混浊的原因。

6、思考题

（1）配置大量元素母液、铁盐母液时，应注意些什么?

（2）配置激素母液时，应注意些什么?

实验1-2植物组织培养基MS的配制与灭菌

1、目的要求

学习植物组织固体培养基的配制，学习高压灭菌器的使用，为外植体的

接种与初代培养做准备。

2、基本原理

在植物组织培养中，固体培养基是最常用的一种培养基类型。

由于培养

基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，主要包括水、大量元素、

微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质，因此，培养基也是微生物繁殖的极好场所。

所以，必需对培养基进行灭菌处理，

以确保无菌操作的顺利进行。

本实验以可用于胡萝卜等植物初代培养的培养基MS+1mg/L2-4D+3%蔗

糖+1%琼脂，pH5.8。

配制1L为例，学习培养基的配制方法。

3、实验仪器和试剂

（1）仪器、用具

高压灭菌锅，超净工作台、分析天平（O.OOOIg）、pH计（或pH试纸）、微波炉、手术剪刀、解剖刀、镊子、药匙、玻棒、称量纸、洗瓶、记号笔、

烧杯（1000ml）、量杯、量筒（1000ml，100ml，50ml）、耐热皮筋（或棉

绳）、100ml三角瓶（每人按3-4瓶准备）、培养皿（每2人按1套准备）、封口膜、定性滤纸等。

（2）试剂

①95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCI。

②MS培养基各母液、

2-4D母液、蔗糖、琼脂。

（1）器皿准备清洗三角瓶、烧杯、量筒、量杯、镊子、手术刀、培

配制的培养基体积（mL）

母液的扩大倍数

养皿、打孔器等，烘干或自然晾干备用。

母液取用量（mL）=

（2）计算母液使用量根据下面公式量取母液:

激素母液用量（mL）=

激素母液浓度（mg/ml）

培养基配制量（L）*激素使用浓度（mg/L）

配制1000ml培养基需要加入各母液的量分别为:

大量元素母液：

100ml微量元素母液：

10ml铁盐母液：

10ml

有机物母液：

10ml激素母液：

（3）配制

称取适量的琼脂（常用量10g/L）置于1000ml大烧杯中，加蒸馏水500ml左右，在微波炉中加热使之溶解，待琼脂完全溶化后，加入蔗糖（常用量30g/L），溶后，加入上述各种母液，最后，加蒸馏水定容到需配培养基的终体积。

每组配制MS固体培养基1000ml，培养基组成为：

MS+1mg/L2,4-D+3%

蔗糖+1%琼脂（PH5.8）。

（4）pH值调节

充分混合，待温度降至50C〜60C时，用1mol/LNaOH容液或1mol/LHCl溶液调pH值到5.8，注意用玻璃棒不断搅动。

（5）分装

搅匀培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中（温度低于40C以下琼脂就

会凝固），每瓶25mL-30mL左右，1000mL培养基可以分装至30〜40瓶，

迅速盖上封口膜，用封口材料包上瓶口，扎口后，写上标记，注明配制者姓名和配制日期，准备灭菌