临床常见细菌的手工鉴定和结果判断Word格式.docx
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第四步:
最后用稀释复红复染(染色液Ⅳ)
⑵.触酶实验(H2O2实验):
a.原理:
具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧,继而形成氧分子出现气泡。
b.方法:
一般用玻片法,就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开,滴加3%过氧化氢数滴,观察结果(立即有大量气泡产生者为阳性,不产生气泡者为阴性)。
要注意不能在血平板上进行实验,这样易出现假阳性;
另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果;
还有不能在接种针或环上进行实验。
c.阳性对照用金黄色葡萄球菌,阴性对照用链球菌;
试剂要避光置4℃冰箱保存。
d.应用:
绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性,链球菌属阴性。
临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属(+),微球菌属(+),链球菌属(-)。
⑶.氧化酶实验(Kovac实验):
a.
原理:
氧化酶又称细胞色素酶,是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。
酶并不直接与试剂(1%盐酸四甲基对苯二胺)起反应,而是首先使细胞色素c氧化,然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化,出现深兰色反应。
b.
方法(滤纸法,菌落法,试剂纸片法):
一般我们采用滤纸法,取白色洁净滤纸条,沾取菌落少许,加试剂一滴,阳性者立即呈粉红色,继而出现深兰色。
结果读取在10秒钟时为最佳,60秒内读取可靠。
本实验避免接触含铁物质(假阳性),也不能在含糖培养基上生长的菌落进行实验(假阴性)。
c.
阳性对照用铜绿假单胞菌,阴性对照用大肠埃希菌。
d.
应用:
奈瑟氏属的菌种均阳性,也用于区别假单胞菌属和肠杆菌,前者阳性,后者阴性。
二.葡萄球菌属的鉴定
葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,腐生葡萄球菌。
1、形态与染色:
葡萄球菌直径0.5~1.5μm,菌体圆形,呈单个,成双以及不规簇状排列。
染色呈紫色,为革兰阳性球菌。
2.与链球菌的区别:
触酶实验为阳性,而链球菌阴性;
菌体形态链球菌小于葡萄球菌,呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球菌。
3.与微球菌的区别:
触酶实验同为阳性,但微球菌的菌体呈四联状,要大于葡萄球菌,微球菌葡萄糖氧化发酵实验(操作方法同甘露醇OF试验)为氧化型;
而葡萄球菌为发酵型。
另外呋喃唑酮(即痢特灵50μg/片)敏感实验微球菌为耐药,而金黄色葡萄球菌为敏感。
4.葡萄球菌属的种间鉴定:
⑴.菌落色素与溶血毒素:
金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色,柠檬色或者淡黄色,而其他葡萄球菌则在血平板上菌落大多数为白色,也有部分为柠檬色或深黄色。
⑵.溶血毒素:
金黄色葡萄球菌有α﹑β﹑γ﹑δ溶血毒素,各毒素的区别是对动物红细胞的溶血范围﹑抗原性及溶血时的温度等。
其中以α溶血毒素为主。
而其他葡萄球菌大多数不产生溶血毒素,只有表葡有极少能产生溶血毒素。
⑶.血浆凝固酶实验:
用与区别金黄色葡萄球菌(阳性),表皮葡萄球菌(阴性),腐生葡萄球菌(阴性)。
血浆凝固酶是金葡菌所产生的,有结合凝固酶和游离凝固酶两种。
血浆凝固酶检测有两种方法,为玻片法和试管法,我们一般采用玻片法。
a.操作方法:
挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血浆乳化,结合凝固酶能作用于血浆中的纤维蛋白原,从而在金黄色葡萄球菌表面发生凝集,所以我们肉眼能看见凝集颗粒。
玻片法主要由结合凝固酶作用产生;
游离凝固酶是金黄色葡萄球菌产生的胞外酶,能与血浆中的血浆凝固反应因子(类似凝血酶的一种物质)作用,形成复合物再使纤维蛋白原转化成纤维蛋白而发生凝集。
试管法主要由游离凝固酶作用产生。
b.注意事项:
菌落不能太多,否则会影响结果观察;
凝固酶阳性要做自凝阴性对照(用生理盐水代替血浆),只有在阴性对照也不凝集才能认为是真正的阳性,有一部分葡萄球菌有自凝现象。
⑷.新生霉素敏感实验:
金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌对新生霉素纸片(5μg/片)敏感;
而腐生葡萄球菌,微球菌则对之耐药。
抑菌环直径>
16mm即为新生霉素敏感。
⑸.甘露醇氧化发酵实验:
a.操作方法:
取两支甘露醇微量生化管,在微量管内接种待检细菌,然后一支加两滴石腊密封,另外一支则不加,放37℃孵箱内18~24h后观察结果。
b.结果观察:
微量生化管变黄色为阳性,也就是能利用甘露醇。
若两管都变黄色则说明是发酵型;
其中加石蜡管不变色,没加石蜡管变黄色则为氧化型;
如果两管都不变色则说明该细菌是不利用甘露醇(产碱型)。
c.应用:
金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘露醇(即两管都变黄色);
表皮葡萄球菌需氧部分产酸,厌氧条件下不利用甘露醇(即没加石蜡管有部分会变黄色,加石蜡管不变黄色);
腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类似。
三.微球菌属的种间鉴定
微球菌属主要的种有易变微球菌,藤黄微球菌,玫瑰微球菌。
鉴定生化见下表
微球菌属的种间鉴定
易变微球菌藤黄微球菌玫瑰微球菌
色素产生黄色黄色粉红色
需氧葡萄糖产酸++-
硝酸盐还原+--
脲素酶dd+
氧化酶-+-/+(弱)
新生霉素敏感S/RSR
d:
不定S:
敏感R:
耐药
四.链球菌属
1.
形态和染色:
链球菌的直径为0.5~1.0μm,呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌,菌体小于葡萄球菌,无鞭毛,没有芽胞,但有些菌株会形成荚膜。
肺炎链球菌呈矛头状,宽端相对,尖端向外。
2.
根据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种:
⑴甲型(α-)溶血,即菌落周围出现较窄的草绿色溶血环;
⑵乙型(β-)溶血,即菌落周围出现较宽的透明溶血环;
⑶丙型(γ-)溶血,即菌落周围无溶血环。
3.
根据抗原结构(C多糖抗原)的不同可分为A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F﹑G﹑H﹑K﹑L﹑M﹑N﹑O﹑P﹑Q﹑R﹑S﹑T等18个群,对人类有致病者90%属于A群,偶见其他群链球菌致病。
4.
链球菌属的种间鉴定
⑴.乙型溶血链球菌的鉴定:
a.
对杆菌肽(0.04U/片)(抑菌圈直径≥10mm)敏感:
A群链球菌(主要为化脓性链球菌)。
b.
对杆菌肽不敏感,胆汁七叶苷实验阴性,但马尿酸钠水解实验﹑CAMP实验阳性:
B群链球菌(主要为无乳链球菌)。
c.
对杆菌肽不敏感,胆汁七叶苷实验阴性,马尿酸钠水解实验阴性,CAMP实验阴性:
主要为马链球菌﹑类马链球菌﹑兽疫链球菌;
对三者的区别实验要加做海藻糖和山梨醇实验。
d.
CAMP实验:
将能产生β-溶血的金黄色葡萄球菌在血平板上划一横线接种,再将待鉴定菌于金黄色葡萄球菌3mm处垂直种一短线,若在有CO2条件下培养5~6小时,或无CO2条件下培养18~24小时,在两细菌连接处出现一个半月型的加强溶血区即为CAMP实验阳性。
⑵.甲型溶血链球菌的鉴定:
草绿色链球菌:
对杆菌肽敏感,对奥普托欣(Optochin)不敏感,胆汁溶菌实验阴性,胆汁七叶苷实验阴性,在高盐中不生长。
主要有变异链球菌,轻型链球菌,血链球菌,唾液链球菌等。
肺炎链球菌:
菌体呈矛头状,成双排列,钝端相对,尖端相背,较葡萄球菌,其他链球菌略大;
在血平板上菌落细小﹑圆形﹑表面光滑﹑灰白色﹑半透明,开始时菌落呈扁平状,以后中心塌陷,呈脐窝状。
与草绿色链球菌的主要区别是胆汁溶菌实验阳性,对奥普托欣(Optochin)敏感。
奥普托欣(Optochin)含量为5μg/片,抑菌环>
18mm为敏感,<
15mm为不敏感,15~18mm应重复实验。
⑶.肠球菌(D群链球菌)的鉴定:
溶血不定,主要是α-﹑γ-溶血;
对杆菌肽不敏感,但其特异性实验是胆汁七叶苷实验阳性;
若能在6.5%NaCl的心浸液肉汤中生长即为D群肠球菌,不能生长为D群非肠球菌。
⑷.链球菌属鉴定的系统生化结果判断
1%美兰牛乳
胆汁七叶苷实验:
变黑为阳性。
PH9.6肉汤实验:
变浑浊为能在碱性环境中生长(阳性)。
6.5%NaCl心浸液肉汤:
由紫变黄为能在高盐环境中生长(阳性)。
e.
精氨酸双水解酶实验:
变红色(对照不变色,仍为黄色)为性
五.奈瑟氏菌属和布兰汉菌属
奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌;
布兰汉氏菌属只有卡他布兰汉氏菌。
两者系需氧革兰阴性球菌。
⑴
奈瑟氏菌的生物学特性:
革兰阴性球菌,需氧,卵圆形或肾形,无动力,氧化酶及触酶均阳性。
培养时对营养要求高,能在巧克力平板或有丰富营养的血平板上,在5~10%CO2环境中生长。
⑵.鉴定过程:
DNA酶实验阳性为布兰汉氏菌,阴性则为奈瑟氏菌。
能在普通血平板上生长的为其他奈瑟氏菌,在巧克力平板上生长的主要为脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。
能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌,不利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏菌。
⑶.几种主要细菌对葡萄糖﹑麦芽糖﹑蔗糖的氧化分解产酸结果如下:
氧化分解产酸
菌种葡萄糖麦芽糖蔗糖
淋病奈瑟氏菌+--
脑膜炎奈瑟氏菌++-
粘液奈瑟氏菌+++
卡他布兰汉菌---
⑷
DNA酶实验:
方法:
将待鉴定细菌点种于含0.2%DNA的DNA琼脂平板上,培养后用1mmol/LHCl覆盖平板,菌落周围出现透明环者为阳性。
原理:
某些细菌能产生DNA酶,可使DNA长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链;
长链DNA可被酸沉淀,而水解后形成后的寡核苷酸链则可溶于酸,故在DNA琼脂平板加盐酸,可在菌落周围形成透明的溶血环。
(肠杆菌科中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生DNA酶,阳性球菌中只有金葡菌能产生DNA酶。
)
六.肠杆菌科
肠杆菌科是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌,其中对人致病性较强的鼠疫耶尔森菌(现已基本没有流行)和伤寒沙门菌;
4类常引起腹泻和肠道感染的细菌(埃希氏菌﹑志贺氏菌﹑沙门氏菌﹑耶尔森氏菌)和8种常导致院内感染的细菌(枸橼酸杆菌属﹑克雷伯菌属﹑肠杆菌属﹑多源菌属﹑沙雷菌属﹑变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属)。
另外还有很多细菌是肠道的正常菌群,但在一定条件下也可致病(条件致病菌)。
实验过程中对于革兰阴性杆菌首先要做氧化酶实验,阴性为肠杆菌科细菌;
阳性的为非发酵菌(我们实验室还没有简单的系统鉴定方法,一般要仪器上卡检测)或弧菌科细菌。
肠杆菌科的系统生化
⑴.KIA试验(克氏双糖铁)
组成:
乳糖/葡萄糖=10/1(斜面/高层,其长度最好是都是2CM)
结果判断:
斜面或高层变黄色:
阳性;
不变色(红色):
阴性
高层中出现裂隙:
产气阳性
高层中出现黑色(FeS):
产H2S阳性
⑵.苯丙氨酸脱羧酶试验
细菌产生的苯丙氨酸脱羧酶使苯丙氨酸氧化脱羧后生成苯丙酮酸,再与10%的FeCl3试剂产成深绿色反应。
(变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属为阳性,其他为阴性)
⑶.枸橼酸盐试验(碳