核黄素测定实验报告docWord格式文档下载.docx
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核黄素(维生素B2)是一种异咯嗪衍生物,它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。
这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。
核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物,同时失去荧光,因而样品的荧光背景可以被测定。
OHHO
OHH3CHNOOHOHHOOHH3CH3C-2HH3CH二氢化物在空气中易重新氧化,恢复其荧光,其反应如下:
核黄素的激发光波长范围约为440—500nm(一般为440nm),发射光波长范围约为510—550nm(一般为520nm)。
利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比,由还原前后的荧光差数可进行定量测定。
根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。
注意:
在所有的操作过程中,要避免核黄素受阳光直接照射。
三.仪器与试剂
1.实验试剂:
核黄素标准品;
冰醋酸;
核黄素药片;
连二亚硫酸钠(保险粉)或亚硫酸钠
2.实验仪器:
荧光光度计(F-2500型)天平(感量0.0001g)
3.实验器材
普通试管:
容量瓶:
移液管:
烧杯:
滤纸:
25mL×
9100mL×
110mL×
15mL×
11mL×
150mL×
19cm
研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒:
各1
四.实验内容
1.核黄素标准液(4×
10-6g·
mL-1)
准确称取核黄素4mg,加5mL冰醋酸和适量蒸馏水,置水浴中避光加热直至溶解。
冷却至室温,用蒸馏水定容至1000mL。
转入棕色瓶中。
2.样品液的制备
为了消除药片之间的差异,可取几片药片一起研磨,然后取部分有代表性的样品进行分析。
将5片核黄素药片称量后磨成粉末,然后从中准确称取1-2mg有代表性的样品,加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水,置水浴中避光加热直至溶解。
冷却至室温,用蒸馏水定容至100mL(如果有沉淀,迅速通过定量滤纸干过滤,用该滤液在与标准溶液同样条件下测量核黄素的荧光强度)。
作样品待测液备用。
3.绘制核黄素的激发光谱和荧光光谱
1).固定激发波长λex(Excitationspectra)为440nm,在460-660nm处测定荧光强度,得溶液的发射光谱,在520nm处得最大发射波长λem。
2).再固定发射波长λem(emissionspectra)为520nm,测定激发波长λex为400-500nm处荧光强度,得溶液的激发光谱,在440nm处得最大激发波长λex。
4.标准曲线制作及样品测定
取8支试管,按下表所示顺序操作。
在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%,则需要再行稀释,并记录稀释倍数。
五.结果处理
1.从绘制的激发光谱和荧光光谱曲线上,确定它们的最大激发波长和最大发射波长。
2.由1~6号管的数据,以核黄素含量(10-6g·
mL-1)为横坐标,F值(F1-F2)为纵坐标,在坐标纸上绘制标准曲线;
—3.求两个样品管F的平均值F;
—4.由F从标准曲线中求样品管中核黄素的含量(10μg·
mL-1);
5.计算药片中核黄素的含量(单位用g/g鲜重),并将测定值与说明书上的值比较。
六.注意事项
1.在所有的操作过程中,避免核黄素受阳光直接照射。
2.使用石英样品池时,应手持其棱角处,不能接触光面,用毕后,将其清洗干净。
3.影响荧光强度的因素很多,每次测定的条件很难完全控制一致,因此每次必须做工作曲线,且标准曲线最好与样品同时做。
F-2500分子荧光光度计操作规程
1.先打开仪器主机,打开电脑
2.点击桌面FL-Solutions
3.寻找激发波长:
放入样品,寻找激发波长,点击Method,出现对话框,点击General,在Measurement中选择wavelengthscan,点击Instrument,在scanmode中选择Excitation,在datamode中只选Fluorescence,在EMWL中输入发射波长数值(520nm)。
在EXstart中输入激发起始波长(400nm),在EXendWL中输入激发终止波长(500nm)。
点击确定即可得到荧光物质的激发光谱曲线。
4.寻找发射波长:
同上法。
在scanmode中选Emission。
在datamode中只选Fluorescence,在EXWL中输入激发波长数值(440nm)。
在EMstart中输入发射起始波长(460nm),在EMendWL中输入发射终止波长(600nm)。
点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。
5.将样品放入,在scanmode中选Emission。
记录在520nm处的荧光值F1。
加入10mg的连二硫酸钠或亚硫酸钠,混合溶解后,立即重新测定相对荧光强度F2
6.在完成测量之后,关闭仪器按下列步骤执行。
(1)从文件菜单(F)中,选择退出(X)指令。
⊙closethemonitorwindow,butkeeplampoperating?
Oclosethelamp,thenclosethemonitorwindow.
选择yes,FLSolutions程序将终止。
(2)关闭光度计的电源开关。
(3)点击Windows98的开始按钮,选择关机(U),在关机窗口对
话框中,选择“关机“OK”按钮。
(4)关闭计算机和显示器电源(在③步中,计算机能通过某些设
定来关闭)。
(5)关闭打印机。
注:
1、关灯:
使用以上指令来关闭氙灯,为了再次打开氙灯,必须重新启动光度计。
2、狭缝宽度一般为5nm或10nm,如果改变狭缝宽度时先选定狭缝宽度,光栅自动关闭,自动调零。
篇二:
作业4尿中核黄素的测定(荧光法)
运动营养学实验报告
姓名:
________学号:
_____日期:
_
_______
备注:
受试者姓名:
性别:
尿液是否稀释:
否
课后思考题
1.维生素B2的测试过程中有哪些注意事项?
为什么?
答:
1.由于核黄素余光分解,整个操作应在避光实验室中进行。
2.做内标准的目的是去除尿中可能存在的有荧光的物质。
3.使用荧光剂时应用荧光红纳校正。
荧光红纳溶液的配制:
溶解25.0mg荧光红钠于少量水中,搅拌使其溶解后加水至250ml,此为储备液。
取0.25ml加水稀释成250ml,此为工作液。
校正步骤:
先选择所需激发波长和发射波长,校正仪器零点,然后用荧光红钠工作也校正荧光计,使指针在某一刻度,再测定样品的荧光强度。
2.营养和运动对机体维生素B2的影响都有哪些?
机体对维生素B2的需求似乎同能量的消耗或肌肉活动有关。
维生素B2缺乏主要发生在素食主义者身上。
如果膳食里未含奶类食品或其他动物脂肪的话,那么机体就有可能缺少维生素B2。
维生素B2与机体的有氧代谢能力关系密切。
运动会导致机体对维生素B2的需求量增加,尤其是生长发育期的儿童少年、控体重、减体重以及素食或不吃动物蛋白的运动者,更要注意的是维生素B2的营养状况。
核黄素主要存在于动物内脏中(如肝、肾、心等),牛奶及蛋类含核黄素也较多,坚果类食品(如核桃、栗子、松子、花生、瓜子等)含量也不错。
若缺乏维生素B2,可适量补充以上食物。
3.为何加入低亚硫酸钠?
核黄素可被低亚硫酸钠还原而失去荧光,故测定还原前后的荧光强度可去除干扰性荧光物质的影响。
篇三:
核黄素
核黄素(维生素B2)荧光光度定量测定法摘要:
维生素B2又名核黄素(Riboflavin),是核醇与7,8-二甲基异咯嗪的缩合物。
由于在异咯嗪的1位和5位N原子上具有两个活泼的双键,易起氧化反应,故维生素B2有氧化型和还原型两种形式,在生物体内氧化还原过程中起传递氢的作用。
在体内核黄素是以黄素单核苷酸(flavinmononucleotide,FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸
(flavinadeninedinucleotide,FAD)形式存在,是生物体内一些还原氧化酶(黄素蛋白)的辅基,与蛋白部分结合很牢。
由于FAD,FAN广泛参与体内各种氧化还原反应,因此维生素B2能促进糖,脂肪和蛋白质的代谢,对维持皮肤,粘膜和视觉的正常机能均有一定的作用。
本实验采用荧光光度定量测定法测量核黄素的含量.
关键词:
核黄素荧光光度还原氧化酶黄素蛋白
VitaminB2andRiboflavin(Riboflavin),isthenuclearalcoholand7,8-dimethylluooxazinecondensationproduct.Duetothedifferentluooxazine1and5Natomhastwolivelydoublebond,easyoxidationreaction,sothevitaminB2typeoxidationandreducedintwoforms,REDOXprocessinbiologicalhydrogentransferfunction.Riboflavininthebodyisflavinmononucleotide(flavinmononucleotide,FMN)andflavinadeninedinucleotide(flavinadeninedinucleotide,FAD)form,aresomereductioninbiologicaloxidase(flavoprotein)prostheticgroup,combinedwithproteinpartisveryfast.BecausetheFAD,FANwidelyparticipateinvariousREDOXreactioninthebody,sovitaminB2canpromotesugar,fatandproteinmetabolism,tomaintaintheskin,mucousmembraneandhavecertaineffecttothe