最新《中国药典》三部注释模板说课讲解Word格式文档下载.docx

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1901年,法国科学家Nocard从患结核性乳腺炎的奶牛身上分离到一株强毒性牛型结核杆菌，后经法国医生卡默特（A.Calmette）和兽医介兰（C.Guerin）在含5%甘油牛胆汁的马铃薯培养基培养，发现牛型结核杆菌毒力逐渐降低，该结果于1907年发表。

此后持续13年，经过230次的连续传代，在1921年动物实验结果证明这株牛型结核杆菌失去了毒力，该菌感染牛、豚鼠、小鼠、猴和家兔都不能使其发病，但能产生免疫力，该菌株达到了疫苗菌株的标准，将其制成疫苗，1921年7月1日疫苗首次应用于人类，经过几年的时间证明其预防结核病安全、有效，于1924年在全球应用推广，1928年法国召开国家科学大会为纪念卡介二氏的功劳，将该菌株制备的疫苗定名为卡介苗（bacelleCalmetteGuerinBCG）。

在二十世纪五十年代前，卡介苗是通过口服途径免疫的，由于口服卡介苗安全性与有效性都存在缺陷，而改由皮下注射、皮内注射以及皮上划痕的方法进行免疫接种，通过实践结果证实，皮下注射会引起脓肿等局部反应；

而皮上划痕的方法难以保证接种的剂量。

因而皮内接种卡介苗的方法得以广泛使用，其剂型也由早期的液体改为冻干，大大提高了接种的效果。

1974年BCG被纳入WHO扩大免疫计划［1］。

至今BCG共约在172个国家、接种40亿人次，每年约1亿儿童接种BCG，是世界上接种人数最多，最安全的疫苗之一。

自原始的卡介苗菌株从巴斯德研究院供应到世界各国后，不同的实验室各自建立了传代方法，多数实验室是在土豆胆汁或土豆苏通培养基上传代与保存，这种传代方式继续应用到40年代中期，在许多地区一直应用到上世纪50、60年代。

经过长期传代，在生物学特性、免疫学特性、保护效果和剩余毒力等方面产生显著差异，形成了不同卡介苗亚株。

目前世界上主要的卡介苗制品的菌株分别为卡介苗巴斯德株（Pasteur1173P2）、丹麦1331株（Danish1331）、日本172株（Tokyo172-1）、莫斯科株（Moscow254）、巴西株（Moreau）等，我国卡介苗菌株为Danish823菌株传代培养而来，名为上海D2PB302PSII甲10菌株，是我国唯一的卡介苗生产用菌株。

我国目前所用BCG为冻干皮内注射用BCG，包括10人份疫苗（含卡介菌0.4～0.6mg）和5人份疫苗（含卡介菌0.2～0.3mg）两种规格。

主要用于3个月以内的婴儿或PPD皮试阴性儿童预防结核病。

目前国内上市仅为5人份疫苗（0.25mg）一种规格。

[制造概要]

1、总体工艺情况及国内外发展状况；

BCG作为一种活疫苗，生产过程主要包括菌体培养、菌体收集和洗涤、菌体研磨、定量稀释等。

目前，国际上BCG生产主要采用表面浮膜培养和深层培养两种技术。

表面浮膜培养是最经典的方法，也是应用最广泛的方法，目前世界上有20多个国家采用该方法。

我国BCG生产采用表膜培养，原液生产工艺可分为菌种接种与培养、菌液收集和研磨两个阶段，大致工艺可概略如下。

启开工作种子批菌种，接种于苏通马铃薯培养基，培养一段时间，挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基表面（S1），37℃-39℃静止培养10-14天，连续在液体苏通培养基上培养2-3次（S2或S3），收集S2或S3菌膜制成100mg/ml菌悬液，取适量菌悬液接种入苏通培养基中（S纱），37℃-39℃培养10-14天，在液体表面逐渐形成菌膜即为纱膜。

用S纱在苏通培养基上传代2-3次，成为纱膜第2代或第3代，培养8-12天的第2代或第3代纱膜可用于制备BCG。

菌种自启开至最终收获物传代代数不能超过12代，每代培养结束后，应逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃［2］。

收集菌膜压干后称湿重，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨，或用手工研磨，加入适量无致敏原稳定剂稀释成一定浓度的BCG菌体原液。

对BCG原液进行纯菌检查和浓度测定，向原液中加入稳定剂，制成1mg/ml或0.5mg/ml半成品。

对半成品进行纯菌检查、浓度测定、沉降率测定、活菌数测定及活力测定，然后分装冻干，即为BCG成品［2，］。

英国、瑞士和荷兰等国采用深层培养技术制备BCG。

将冻干菌种开启重溶后种入改良罗氏鸡蛋培养基表面，在罗氏培养基上至少传2代，第3代在液体Dubos培养基中深层培养，液体培养基中通常需要加Tween80或TritonWR1339。

卡介菌在液体培养基中呈均匀分散的生长。

然后离心收集菌体、洗涤、再离心集菌，加保护液，制成所需浓度的BCG。

2、关键工艺步骤原理及控制条件；

疫苗的质量安全、有效和一致性，除了依赖于对疫苗的全面检定，更重要的生产过程中科学、严格的质量控制。

BCG生产过程中的质量控制主要从如下几方面进行。

种子批的质量控制

历史上曾因BCG生产用菌种错误出现严重不良反应的的深刻教训，严控生产用菌种十分重要。

我国目前使用D2PB302种子批作为BCG生产用菌种，严禁使用通过动物传代的菌种制造BCG。

生产用菌种采用种子批系统，原始种子批样验明其记录、历史、来源、和生物学特性。

从原代种子批传代、扩增后冻存保存为主种子批。

从主种子批制备工作种子批。

主种子批核工作种子批得各种特性应与原始种子批一致。

BCG种子批生产前应作严格检定，检定合格后方可用于生产，工作种子批启开至菌体收集传代应不超过12代。

主要从以下几方面进行BCG生产用种子批的质量控制。

①培养特性

BCG在苏通培养基上经37～39℃培养，生长良好、抗酸染色为阳性。

在苏通马铃薯培养基上培养的卡介菌应是干皱成团略呈浅黄色。

在牛胆汁马铃薯培养基上为浅灰色黏膏状菌苔。

在鸡蛋培养基上有突起的皱型和扩散型两类菌溶，且带浅黄色。

在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱、微带黄色的菌膜。

②毒力试验

用结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）皮肤试验阴性、体重300～400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周称体重，观察5周动物体重不应减轻；

同时解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。

③无有毒分枝杆菌试验

用TB-PPD皮肤试验阴性的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射1ml浓度为10mg／ml菌液，注射后豚鼠体重不应降低，6周和3个月时分别解剖3只豚鼠，各脏器应无肉眼可见的结核病变；

若有可疑病灶，应做涂片和组织切片检查，并将部分病灶磨碎，加少量生理氯化钠溶液混匀后，皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃；

当试验未满3个月时，豚鼠死亡则应解剖检查，若有可疑病灶，即按上述方法进行，若证实系结核病变，该菌种应废弃；

若证实属非特异性死亡，且豚鼠死亡1只以上应复试。

④免疫力试验

用种子批菌种制备疫苗，经4只300～400g豚鼠分别皮下注射0.2ml疫苗（1/10人用剂量），对照组注射0.2ml生理氯化钠溶液。

豚鼠免疫后4～5周，经皮下攻击103～104强毒人型结核分枝杆菌，攻击后5～6周解剖动物，免疫组与对照组动物的病变指数及脾脏毒菌分离数的对数值应有显著差异。

菌种培养和传代中的质量控制

卡介苗作为一种减毒活疫苗，菌种的安全、可靠至关重要。

首先，必须严格按照种子批管理系统，启用和保存菌种，严禁使用通过动物传代的菌种制造BCG。

其次，菌种传代和培养的质量高低直接影响疫苗质量。

我国BCG生产采用表膜培养技术，培养过程中，表面菌膜的质量至关重要，通常液体表面形成生长快、薄而多绉并富于弹性的菌膜，适合扩大传代。

冻干菌种在马铃薯培养基上培养获得的菌种如果不能及时传代，可于2-8℃保存，但保存时间不得超过2个月。

生产过程中，为了简化程序和降低工作量，可将传代过程中获得的纱膜移入冷藏室中保存，下次生产时可直接将纱膜接种入苏通培养基中，而不必每次生产都用马铃薯培养基获取第一代菌膜。

但纱膜在冷藏室的保存时间应控制在2个月以内，并且每代纱膜均需作纯菌检查。

在传代过程中，每代培养结束后，均需逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应予废弃。

另外，应确保菌种自启开至最终收获物传代代数不能超过12代，以保证疫苗的质量稳定。

菌种培养过程中应将温度控制在37-39℃，培养时间也应严格控制，通常，纱膜接入液体培养基中，培养时间应控制在14-21天，液体培养基菌膜直接接入液体培养基，只需培养6-8天即可，用于制备纱膜或BCG原液的菌膜培养时间控制在8-12天。

培养基的质量控制

卡介苗生产用培养基为苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基。

通常，卡介菌培养第一代，即冻干菌种的复苏，使用苏通-马铃薯培养基或胆汁马铃薯培养基，以后各代培养均使用液体苏通培养基。

其中的氮源有必要进行控制，通常将液体培养菌膜直接转接液体培养基时，待接种培养基使用谷氨酸钠作为氮源，其他各代培养多用天冬素作为氮源。

原液收集和合并（菌体收集和研磨）中的质量控制

培养结束后，应逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃。

收集菌膜压干，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨。

加入适量无致敏原稳定剂稀释，制成原液。

由于水分压干程度不同，同样湿重下的疫苗所含实际活菌量不同，进而影响疫苗浓度，故在对收集的菌膜进行压干去除水分时，压力控制是必要的，通常根据收集的菌量调整压力。

同样，菌体经研磨后获得大小不一的菌团，菌团大小可能和临床上BCG的不良反应有关，通常菌团越大，越易引起局部反应并可在淋巴结处滞留而引起强反应，因此，压干的菌块移入装有不锈钢株的球瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在适宜范围，研磨时间也应根据菌量确定。

同时应对菌液均匀度进行监测，以保证生产过程的一致性。

总之，在菌体收集、压干和研磨过程中中，应对压力和研磨转速及时间设计相应的过程参数并经充分验证。

[检定]

按照原液检定，半成品检定和成品检定分别进行描述，说明检定项目设定的原则、意义；

1、原液检定

原液检定有两个项目，分别为纯菌检查和浓度测定。

⑴纯菌检查按现行版药典无菌检查法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。

纯菌试验是疫苗的安全性试验之一，保证疫苗制品不含杂菌。

⑵浓度测定用国家药品检定机构分发的1mg/ml的冻干卡介苗参考比浊标准，以分光光度法测定原液浓度，浓度范围为60-120mg/ml。

原液浓度=（样品A580nm/标准品A580nm）×

稀释倍数×

1mg/ml。

浓度测定的设定是为了确保疫苗有效成分的含量，并监测生产过程的一致性。

2、半成品检定

半成品检定有5个项目，分别为纯菌检查、浓度测定、沉降率测定、活菌数测定、活力测定。

⑴本成品纯菌检查同原液的纯菌检查。

⑵半成品浓度测定同原液的浓度测定，应不超过配制浓度的110%。

半成品浓度=（半成品A580nm/标准品A580nm）×

1mg/ml

⑶沉降率测定，可以和浓度测定同时进行，将浓度测定后的半成品室温静置2小时，再检测A580nm，计算静置前后2小时吸光度值的变化，应不大于20%。

通过检测沉降率，可以了解菌液的均匀性及菌团的大小，从而控制制品的质量，同时也监测生产过程的