分子生物学前沿技术Word格式文档下载.docx

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1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Lasercapturemicrodissection，LCM），次年，美国ArcturusEngineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。

应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。

这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1] 

。

原理：

LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylenevinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上[2]。

LCM系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机与彩色显示器。

用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准0.5ml离心管相匹配。

机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。

显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜局部熔化。

熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。

组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。

激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。

将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验[3]。

EVA膜约100~200μm厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°

C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。

采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。

优缺点：

LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。

结合组织结构特点以与所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。

LCM与以显微操作仪为基础的显微切割技术相比[4]，具有以下优点：

（1）分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；

（2）捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较好地控制捕获细胞的特异性；

（3）捕获细胞与塑料帽结合紧密，减少了组织损失的风险。

相比而言，除了激光切割弹射微分离系统[5]以经染色的用于存档的切片也可被成功进行显微切割。

尽管LCM应用广泛，但对于常规染色、固定且不加盖玻片的组织切片，其视觉分辨率受到很大限制。

而对于那些本身缺乏一定结构特点的复杂组织（如淋巴组织，广泛浸润的腺癌等），要准确分离出某一类细胞几乎是不可能的。

Fend等[6]通过采用特殊染色，尤其是免疫组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目，从而解决了上述难题。

应用LCM，偶尔会出现无法将选择的细胞从切片上移走的情况，出现这种结果有两种原因：

（1）细胞与热塑膜之间的粘合力不足，通常是由于组织未完全脱水或激光的能量设置过低造成的；

（2）组织切片与载玻片间的粘合力过强，通常发生在显微切割干燥时间过长的冰冻切片。

针对不同样本组织（包括免疫组化染色的组织切片），一些研究小组分别详尽报道了采用适合的处理方法，以达到最佳的显微切割条件[7] 

应用：

LCM较以往的显微切割技术有了突破性的进展，现已广泛应用于肿瘤研究，包括前列腺癌[8]、肾癌、肺癌、甲状腺癌[9]、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、恶性胸膜间皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。

此外，LCM还成功应用于其它一些疾病的研究中，如Crohn病 

[10]、肌萎缩性侧索硬化症[11]、子宫内膜异位症、获得性免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。

而应用LCM所分离的组织也多种多样，包括单个细胞、单一细胞群（主要是癌巢）、血管等类型。

展望：

LCM成功解决了组织异质性问题，且具有迅速、准确等诸多优点，已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平的研究中，并显示出了良好的应用前景[1]。

但今后可能还需要以下几个主要方面的发展和完善：

理论上，除上述组织与细胞以外，LCD还可应用于其他所有组织细胞（如脾脏巨噬细胞、肝脏Kuffer细胞等）的分离，但其各自的切片制备、染色等技术方法尚需要进行探索；

开发相应的应用程序，仅需输入目标细胞或组织的特异性参数即可实现计算机自动控制LCD[12]，从而大大缩减所需的人力和时间；

提高捕获单个细胞的精确度，以减少非目标组织的沾染；

进一步优化快速免疫组化染色的步骤，改进DNA和RNA抽提技术，实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量的核酸。

变性高效液相色谱分析（denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC）

在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。

异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。

用离子对反向高效液相色谱法：

⑴ 

在不变性的温度条件下，检测并分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段，类似RFLP分析，也可进行定量RT—PCR与微卫星不稳定性测定（MSI）；

⑵ 

在充分变性温度条件下，可以区分单链DNA或RNA分子，适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制；

⑶ 

在部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程，不仅分别形成同源双链，同时也错配形成异源双链，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离，从而识别变异型。

根据这一原理，可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析SNPs等方面的研究。

优点：

近年来建立并迅速发展的DHPLC是一种新型基因突变筛查技术，既能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。

而目前已有的许多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性（single-strandconformationpolymorphism，SSCP）、变性梯度凝胶电泳法（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）等均不能满足此要求。

DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。

与传统的SSCP、DGGE等方法相比，DHPLC有较多的优点。

SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；

DGGE则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。

而DHPLC则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。

DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。

当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。

多重连接探针扩增技术（multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA）于2002年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。

该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。

MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离与数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。

每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；

每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。

在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。

连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；

反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。

连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。

最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。

只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。

检测染色体亚端粒的基因重排智力低下是遍与全世界的严重危害儿童身心健康的一类疾患，其中一部分是由可知原因引起的，包括感染、中毒、脑疾病等，但是很大一部分患儿的病因不明。

近几年的研究发现，包括亚端粒在内的基因重排是引起智力低下的重要原因[M,N]，因为亚端粒的基因非常丰富，微小的改变就会累与众多的基因，从而导致疾病的发生。

目前，应用较多的检测染色体亚端粒的方法包括染色体核型分析，荧光原位杂交（FISH），但是前者不能检出亚端粒微小的基因重排，而后者费时、费力、又非常昂贵，不易推广。

MLPA-P036和MLPA-P070试剂盒，针对每一个染色体的末端都设计有一个特异性探针，它经济、高效、快速，可以用于检测亚端粒的基因重排[P,Q]，揭示部分智障患儿的发病原因。

检测染色体的非整倍性改变[S,T]目前，检测染色体的非整倍性改变的方法主要为染色体核型分析，但是它在检测羊水细胞、绒毛或是其他胎儿细胞时，需要进行体外细胞培养，若培养失败、细胞过少或染色体形态较差时，常常影响实验结果。

应用MLPA检测这类标本时，不需要体外培养，少量标本即可进行检测，针对易发生非整倍性改变的染色体（13，18，21，X，Y）上的几个热点基因设计特异性探针，根据特定基因拷贝数的改变，即可确定染色体数目的异常。

检测单核苷酸的多态性（SNP）和点突变根据MLPA的原理可知，靶序列DNA只要有一个碱基的改变，便可导致杂交不完全，使其扩增产物缺失，因此，MLPA高度特异性的检测可用于多种SNP和点突变。

几种常见的儿童遗传性疾病的检测

1）智力低下综合征多种已知的智力低下综合征与染色体特定区域的基因改变相关。

这些患儿临床表现复杂，个体差异大，缺乏特征性表现，医生很难作出准确诊断。

MLPA-P064试剂盒，针对特定的染色体区域设计了43个探针，可以明确几种疾病的诊断[A]，包括：

1p-缺失综合征，Williams综合征，Smith-Magenis综合征，Miller-Dieker综合征，Digeorge综合征[W]，Alagille综合征，Sotos综合征。

根据同样的原理，MLPA-P096试剂盒可检测的疾病包括：

Wolf-Hirschhorn综合征，CriduChat综合征，WA