分子实验室细胞实验室常用配方Word格式.docx

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●10％SDS（十二烷基硫酸钠）：

SDS粉末10g

ddH20定容到100ml

注意：

用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡

●6X蛋白质samplebuffer

Tris-HCl（1M,pH6.8）30mL

SDS10g

甘油30mL

DTT（154.25）9.3g

溴酚蓝0.06g

ddH20定容至100mL

●10XPBS缓冲液的配制：

NaCl80g

KCl2g

Na2HPO414.4g（十二水合36g）

KH2PO402.4g

加800mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到7.4，调好pH再定容到1升。

配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度

●PBST（1X）

PBS（1X）500ml

Tween20500μl

●50×

Tris-乙酸（TAE）缓冲液配制1L溶液各成分的用量

Tris粉末242g

冰醋酸57.1ml

Na2EDTA·

2H2O37.2g

ddH20定容到1L

●封闭液

脱脂奶粉5g

叠氮钠0.02g（现配现用时可不加）

PBS定容到100mL

●染色液（室温）

1L

500ml

200ml

100ml

甲醇

500mL

250

100

50

乙酸

100mL

20

10

R250考马斯亮蓝

0.5g

0.25g

0.1g

0.05g

H20

400mL

200

80

40

●脱色液：

（室温）

甲醇165mL

乙酸50mL

H20785mL

●8.8Buffer:

（调pH至8.8,4度保存）

Tris

18.17g

36.34g

10%SDS

4mL

8ml

ddH20

定容至100mL

●6.8Buffer:

（调pH至6.8,4度保存）

6．06g

12.12g

●转移缓冲液（10×

transbuffer）：

（常温保存）

2L

甘氨酸

144g

288g

Tris粉末

30.3g

60.6

定容至1L

定容至2L

使用时甲醇200mL

转移缓冲液（10×

）100mL

ddH20700mL

●电泳缓冲液（10×

）（runningbuffer）：

10g

20g

●10Х）TBS:

（常温保存）

NaCl80.0g

Tris粉末24.2g

ddH20定容至1L

●TBST（1X）

TBS（1X）500ml

Tween20500μl

●Strippingbuffer（可反复利用）温老师组配方

10%SDS10ml

Β-巯基乙醇350μl

Tris-HCI（pH6.8）6.25ml（6.06加到50mL水）

加入ddH2O至50mL

●Strippingbuffer（可反复利用）郭老师给配方

甘氨酸15g

SDS1g

Tween201ml

ddddH2O1L

作这个buffer洗20min，然后用PBST洗3次，再重新封闭孵抗体。

（二）细胞和细菌培养基、抗生素

●LB培养基（当天灭菌后放4度存放）

1000ml

300ml

250ml

200ml

氯化钠

5g

3g

2.5g

2g

蛋白胨

酵母提取物

1.5g

1.25g

定容至1000ml

定容至500ml

定容至300ml

定容至250ml

定容至200ml

●LB平板：

（当天灭菌后倒平板，放4度存放）

琼脂

15g

7.5g

4.5g

3.725g

●SOB培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋白胨20g

酵母提取物5g

氯化钠0.5g

1mol/L氯化钾2.5ml

用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁

●1MIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3））溶液

IPTG粉末2.383g

ddH20定容到10ml

用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

●Amp+（50mg/ml）

Amp+粉末50mg

ddH201ml

分装保存于-20度，使用时按1000：

1的比例用

●Kana+（50mg/ml）

Kana+粉末50mg

●胰酶：

抽滤，长期保存可放负20度

粉末0.25g

EDTA0.02-0.03g

1XPBS100ml

●高糖DMEM培养基：

抽滤保存在4度

粉末全部

碳酸氢钠3.7g

ddH20定容到1L（用盐酸调pH值到：

7.2-7.4）

●G418母液（100mg/ml）用0.22μM滤菌，分装存于-20度

粉末1g

PBS10ml

●zeocin母液（100mg/ml）用0.22μM滤菌，分装存于-20度

ddH2O10ml

●Blasticidin（100mg/ml）用0.22μM滤菌，分装存于-20度

粉末0.3g

（三）利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方

透析液配方

母液浓度

量取体积

Tris-HCl（pH:

8.0）

20mM

1M

20ml

NaCl

4M

5ml

MgCl2

2mM

2ml

DTT

1mM

1ml

甘油

50%

500ml

ddH2O

472ml

●超声裂解液（lysisbuffer）：

2011年做蛋白纯化时用

Na3PO4（164）8.2g（50mM）

NaCl（58.5）17.55g（300mM）

加800mLddH2O溶解，用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0，再定容到1升。

配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。

●洗涤液（washbuffer）：

2011年做蛋白纯化时用

Na3PO48.2g（50mM）

NaCl17.55g（300mM）

咪唑0.681g（10mM）

加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升

●洗脱液（elutionbuffer）：

2011年做蛋白纯化时用

咪唑17.025g（250mM）

加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升）

PrepEase®

Histidine-TaggedProteinPurificationKits-HighSpecificity

●8XLEWBuffer（Lysis-Equilibrium-WashBuffer）：

（室温保存）pH：

8.0

NaH2PO4.2H2O6.2404g（400mM）

NaCl14.0256g（2.4M）

dH20定容到100mL（调节pH：

●4XElutionBuffer：

NaH2PO4.2H2O3.1202g（200mM）

NaCl7.0128g（1.2M）

咪唑6.81g（1M）

dH20定容到100mL（调节pH：

●EDTA:

（100mM）

EDTA2.923g

dH20定容到100mL

●NiSO4:

NiSO4.6H2O2.6285g（100mM）

dH20定容到100mL

●溶菌酶：

（使用时1ml溶液加入20ul）

粉末50mg

ddH201mL

（四）利用His-tag从细胞中富集蛋白配方

●磷酸钠缓冲液

按图示比例混合0.2MNa2HPO4溶液和0.2MNaH2PO4溶液，得到两种缓冲液，pH分别调节成为8.0和6.3.

pH

0.2MNa2HPO4体积/mL

0.2MNaH2PO4体积/mL

6.3

11.25

38.75

47.35

2.65

●细胞裂解液（最好新鲜配制，当天使用）

Celllysisbuffer

配10ml

配15ml

配20ml

配40ml

配30ml

盐酸胍（g）

6M

5.7318

8.5977

11.4636

22.9272

17.1954

Tris（g）

10mM

0.012114

0.018171

0.024228

0.048456

0.036342

pH8.0buffer（ml）

100mM

5

7.5

15

（注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须8.0!

）

（注意二价阳离子螯合剂，还原剂，会导致镍从树脂上的洗脱）

本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1mM,DTT浓度不超过5mM，巯基乙醇浓度不超过20mM。

●pH8.0的洗脱溶液（最好新鲜配制，当天使用）

pH8.0的washbuffer

配100ml

配50ml

Urea尿素（g）

8M

48.048

24.024

9.6096

19.2192

14.4144