浅论JNK在惊厥持续状态幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响Word格式文档下载.docx
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RT-PCR技术检测海马JNK1mRNA表达的动态变化。
结果:
SC组在惊厥12h后的各时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数均显着高于NC组(),而ED组TUNEL阳性细胞数均较SC组显着下降(P或P)。
幼年大鼠海马CA1区p-JNK蛋白在SC组表达显着增强,与NC组比较差异有显着性(P),在EDA组表达较SC组明显下降(P)。
SC组海马JNK1mRNA表达明显高于NC组(P),而在EDA组JNK1mRNA的表达较SC组显着降低(P)。
结论:
SC可诱导JNK的表达,促进SC后海马神经元凋亡;
EDA预处理可以影响JNK的表达,减轻惊厥后海马神经元凋亡程度。
【关键词】惊厥;
脑损伤;
幼年大鼠;
JNK;
依达拉奉
Abstract:
Objective:
ToobservethechangeofJNKinthehippocampusofstatusconvulsiveratandtheregulationeffectofEDAonit.Methods:
OnehundredandtwentymaleJuvenileSprague-Dawley(SD)ratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup(NC),statusconvulsivusgroup(SC),andedaravonegroup(EDA);
andeverygroupwererandomlydividedintofivegroups,whichwouldbeexecutedat4h,12h,24h,48hand72hafterconvulsiondiscontinued.Statusconvulsivus(SC)wasinducedbyinjectingLithiumChlorideandPilocarpine.GroupEDAwereinjectedEDAbeforeconvulsion,andrepeatedlyeverydayfor3days.TheexpressionofapoptosiscellswereobservedwithTdT-mediateddUTPnickendlabeling(TUNEL),thechangesofp-JNKproteininthehippocampusCA1domainsweredetectedwithimmunohistochemistry(IHC),theexpressionofJNK1mRNAweredetectedwithRT-PCR.Results:
TheTUNELpositivecellsinhippocampusCA1ofSCgroupweremorethanthatofNCgroupat12haftertheSC(P).Aftertheinterventionofedaravone,TUNELpositivecellsshowedasignificantdrop(P orP).Theexpressionofp-JNKproteininthehippocampusCA1domainsincreasedmarkedlyinSCgroup.ThedifferencewasstatisticalysignificancecomparedwithNCgroup(P),andEDAgroupwasmuchlowerthanSCgroup(P).TheexpressionofJNK1mRNAinthehippocampusinSCGroupwasmuchhigherthanNCGroup(P),andEDAgroupwassignificantlylowerthanSCgroup(P).Conclusion:
SCmaybeincreasetheexpressionofJNK,JNKmaybemediatedtocellapoptosis.EDAcaneffecttheexpressionofJNK,andlessenthepothologyofhippocampus.
Keywords:
convulsion;
braininjury;
juvenilerat;
edaravone
惊厥是小儿时期较常见的急症。
当惊厥反复发作而未能很好控制时,可导致进行性脑损伤,并可造成认知损害[1]。
多种因素导致神经元坏死和细胞凋亡是惊厥性脑损伤的基本原因。
JNK(C-JunN端激酶)是凋亡途径中重要的信号分子,已有部分学者对其参与神经元凋亡的情况做了研究。
然而在惊厥持续状态(statusconvulsive,SC)后的表达情况目前尚未见相关报道。
依达拉奉(edaravone,EDA)对低氧缺血性脑病的神经元保护作用已得到证实,但其对于SC后JNK的表达及神经元凋亡的影响情况,国内外尚未见报道。
本实验通过建立氯化锂-匹鲁卡品SC大鼠模型,观察幼年大鼠海马p-JNK蛋白及JNK1mRNA表达的变化,及依达拉奉对SC后海马JNK表达及神经元凋亡情况的影响,初步探讨JNK与惊厥性脑损伤的关系及依达拉奉在SC幼鼠中可能的神经元保护机制。
1材料和方法
实验动物和试剂清洁级健康幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自中国科学院上海分院试验动物中心)120只,体重50~70g。
氯化锂、匹罗卡品购自美国Fluka公司,细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司。
鼠抗p-JNK单克隆抗体购自美国Stancru公司。
M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司,依达拉奉由南京先声东元制药有限公司资助。
实验分组和SC动物模型的建立随机将SD大鼠分为正常对照组(NC组)、惊厥持续状态组(SC组)、依达拉奉组(EDA组)三大组,每组40只大鼠;
各大组再随机分为5小组,分别于惊厥后4、12、24、48和72h处死。
若因模型不成功、死亡造成各亚组样本量不足8只的,按随机原则补足。
采用氯化锂-匹鲁卡品法制作SC模型。
SC模型制作参照胡越等方法。
惊厥按Racine分级标准分为V级,惊厥发作达到IV-V级,持续时间至少30min,惊厥解除后状态良好的大鼠为合格SC大鼠模型。
NC组:
不作任何处理。
EDA组:
造模前3d予EDA3mg/kg腹腔注射,每天注射一次,连续3d,其余用药同SC组。
动物标本的制备大鼠分别于惊厥后各时间点处死。
经10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉后,断头剥离颅骨,完整取出脑组织置于冰盘上,分离右侧海马脑组织,放入去RNA酶的EP管中,迅速置于液氮中保存。
左侧大脑在垂直视交叉处离断,并冠状位向后切取约5mm,放入预冷的4%多聚甲醛固定12h,入70%乙醇,送病理科进行石蜡包埋;
石蜡包埋后制片,切片厚度为5μm。
实验方法
TUNEL检测凋亡细胞:
具体操作步骤参照试剂盒说明书。
二氨基联苯胺(DAB)显色,中性树脂封片。
结果判定:
细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡的细胞;
光镜下每组各选阳性细胞最集中的5个高倍视野,计算出每个高倍视野的阳性细胞数,取其平均值。
免疫组织化学检测p-JNK蛋白表达:
石蜡切片融蜡水化后,用EDTA进行抗原修复,滴加50μL鼠抗p-JNK抗体(1:
100)4℃过夜后滴加二抗,DAB显色,中性树脂封片。
显微镜下观察,阳性细胞为胞核中出现棕黄色。
每张切片随机选择5个镜下视野(×
200),应用image-proplus图像分析软件测定阳性部位的平均光密度(opticaldensity,OD),以代表阳性部位的蛋白表达水平。
RT-PCR技术检测JNK1mRNA表达:
①引物设计和合成。
检索GenBank数据库中ratJNK1、GAPDH的mRNA序列,利用primerpremier软件设计引物,然后经过Blast匹对,由上海生工生物工程有限公司合成,用前法稀释成10pmol/μL,引物序列及预期PCR产物长度如下(见表1)。
②总RNA的提取。
采用Trizol一步法抽提海马总RNA提取,一切操作步骤均按Trizol试剂盒说明书进行。
③cDNA的合成。
应用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒,一切步骤均按说明书进行。
④PCR。
采用单基因扩增法,配制20μLPCR反应体系,然后经PCR扩增,PCR扩增条件:
94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃复性30s,72℃延伸40s,34个循环,最后经72℃延长8min。
以GAPDH为内参照。
⑤图像分析。
产物在%琼脂糖凝胶电泳后,用FR-980生物电泳图像分析系统获取凝胶图像,观察分析JNK1mRNA的转录情况,测定PCR产物电泳条带扫描灰度值。
以GAPDH作为内参照进行半定量分析比较,以其比值进行统计学分析。
统计学处理方法多组比较采用单因素方差分析,均数的两两比较采用LSD-t检验,两变量的相关采用直线相关分析法分析。
2结果
各组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞表达结果(见图1)TUNEL结果显示,TUNEL阳性细胞主要在神经元及神经胶质细胞,胞核中出现棕黄色颗粒,形成典型的“指环状”或“半月状”的细胞凋亡特征。
SC组海马CA1区TUNEL阳性细胞于惊厥后4h已有少量表达,48h达高峰,之后有下降趋势;
其24、48、72h三个时间点均明显高于NC组(P)。
EDA组24、48和72h时间点TUNEL阳性细胞表达水平较SC组均明显降低(P);
但仍高于NC组(P)(见表2)。
大鼠海马p-JNK蛋白免疫组化结果(见图2)免疫组化结果显示,NC组p-JNK蛋白在神经元和神经胶质细胞的胞核少量表达。
SC后4h海马CA1区p-JNK蛋白表达即开始增加,48h达高峰,72h下降。
而EDA组惊厥后各时间点海马p-JNK蛋白表达水平较SC组降低,以24和48h时间点为着(P)(见表3)。
各组大鼠海马JNK1mRNA的表达(见图3)RT-PCR方法检测到NC组大鼠海马JNK1mRNA少量表达。
SC组JNK1mRNA的表达于惊厥后4h开始增加,48h达高峰,72h下降。
而EDA组惊厥后24和48h时间点海马JNK1mRNA表达水平较SC组均明显降低(P)(见表4)。
相关性分析大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞与CA1区p-JNK蛋白表达呈正相关(γ=,n=80,)。
海马CA1区TUNEL阳性细胞与JNK1mRNA表达正相关(γ=,n=80,)。
3讨论
在人类颞叶癫痫患者以及电点燃或化学点燃、局部或系统给予致痫剂等各种癫痫模型