浅论伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究Word文件下载.docx

浅论伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究Word文件下载.docx

《浅论伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浅论伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究Word文件下载.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

【关键词】伤寒沙门菌；

UhpA；

凝胶阻滞；

基因表达调节

　　［Abstract］Objective:

ToexplorethefunctionoftheregulatorUhpAinSalmonellaentericaserovarTyphi.Methods：

ArecombinantplasmidpBADuhpAcontainingtheuhpAgenewithitsownpromoterwastransferredintotheuhpAdeletedmutantof　serovarTyphi.qRTPCRwasperformedtoobservetheexpressionofcysMandtreB.UhpAproteinwasexpressedbyarecombinantplasmidpET22buhpAin　ThegelshiftassayswasperformedtoexplorethecombinationbetweenUhpAandthepromoterregionofcysMand:

RecombinantplasmidpBADuhpAwassuccessfullyconstructed.AftercomplementinguhpAgeneintheuhpAdeletedmutant,theexpressionofcysMandtreBwasobviouslyrestored.GelshiftassaysshowedthatUhpAproteincouldnotbindthepromoteregionofcysMandtreB.Conclusion:

Atupshifthighosmotictreatment,theUhpAmaypromotetheexpressionofgenesinvolvedinthemetabolismofsulfurandtrehaloseindirectly.

　　［Keywords］SalmonellaentericaserovarTyphi;

UhpA;

gelshiftassay;

geneexpressionregulation

　　伤寒沙门菌是沙门菌属中一种人类严重的肠道致病菌，已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调控研究的模式菌［1］。

沙门氏菌在感染的过程中，必须适应新环境，对不同环境的调节主要由细菌多种双组分调节系统中已发现数十种双组分调节系统。

　　UhpB/UhpA作为一种双组分调节系统，调控转运蛋白UhpT的表达，从而有助于细菌利用外界环境中的6磷酸葡萄糖作为碳源或能量来源［3］。

我们最近的基因芯片相关分析表明，uhpA基因缺陷变异株在高渗应激条件下相对于野生株有一系列基因的表达发生了明显的下调，而且这些基因大多与硫代谢相关。

这提示在高渗应激条件，uhpA基因可能参与硫代谢途径的调控［45］。

为了深入地研究UhpA的功能，我们在uhpA基因缺陷变异株中回补uhpA基因，通过qRTPCR观察其对下调基因表达的影响，同时表达UhpA蛋白，通过凝胶阻滞试验，分析UhpA对于硫代谢途径的相关基因是直接还是间接调控。

　　1材料与方法

　　材料

　　菌株和质粒

　　菌株：

伤寒沙门菌野生株GIFU10007，uhpA-，uhpA-，uhpA-、大肠埃希菌DH5α，TG1，JM109，JM109

　　质粒：

pBAD/gIII，pET22b，pBADuhpA，pET22buhpA

　　主要试剂

　　限制性核酸内切酶BamHⅠ，SalⅠ，NcoⅠ，T4DNA连接酶，ExTaq，pfuTaq，无RNA酶的DNA酶Ⅰ，TA克隆试剂盒均为TaKaRa公司产品；

琼脂糖，胶回收试剂盒均为Promega公司产品；

蛋白纯化系统，总RNA提取试剂盒为Qiagen公司产品；

反转录试剂盒SuperScriptⅢ；

GSM缓冲液根据相关文献配制［6］。

　　主要仪器

　　PCR扩增仪2700（ABI）；

凝胶成像系统GeneGeniusBioimagingSystem（BioRad）；

电转化仪GenePulseroII（BioRad）；

核酸检测仪SpectrophotometerND1000；

荧光定量PCR仪；

垂直平板电泳仪。

　　引物合成

　　本文所用引物均由上海生工生物技术公司合成，引物序列见表1。

表1引物序列

　　方法

　　uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因　

　　分别在uhpA基因上、下游设计引物Fa与Fb并在5′端加NdeⅠ,XhoⅠ酶切位点，以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的基因，将纯化后的PCR产物与载体pBAD/gⅢ同时用NdeⅠ,XhoⅠ双酶切，酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后用T4DNA连接酶22℃过夜连接。

连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1，筛选疑似阳性克隆并用NdeⅠ,XhoⅠ双酶切和PCR分析鉴定，并经基因序列分析验证。

将构建成功的重组载体pBADuhpA转入uhpA缺陷变异株，将其命名为uhpA回补株uhpA-（pBADuhpA），同时将空pBAD/gⅢ载体导入uhpA缺陷变异株作为对照株uhpA-。

　　细菌培养及总RNA提取

　　挑取GIFU10007，uhpA-和uhpA-单菌落接种于1ml等渗LB培养液中，37℃振荡培养过夜，以1∶100分别转接于20ml等渗LB培养液中，LB培养液中均加入了%的L阿拉伯糖，37℃振荡培养4h至对数生长期，再加入终浓度为300mmol/L的NaCl培养30min。

冰上放置15min后离心收集菌体。

用总RNA提取试剂盒提取细菌总RNA，并用无RNA酶的DNA酶Ⅰ消化残量DNA。

用核酸检测仪检测RNA浓度，同时取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，分析RNA的质量。

-70℃保存RNA备用。

　　qRTPCR

　　采用上述方法提取和处理细菌总RNA，取4μg总RNA，用N8随机引物，按照反转录试剂盒操作进行反转录。

从筛选的差异表达基因中，选取2个差异基因，用特异性引物进行qRTPCR，观察基因表达。

qRTPCR采用SYBRGreen并按文献［6］进行，用基因组DNA梯度稀释制作相应的标准曲线，据样品测定的初步结果确定标准品浓度范围。

采用基因特异性引物进行扩增，扩增产物长度cysM为265bp，treB为290bp，序列信息见表1。

　　UhpA蛋白的表达纯化

　　分别在uhpA基因上、下游引物的5′端加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，去除基因本身的终止子，利用载体上His6后面的终止子，使表达的UhpA蛋白C末端带有His6标签。

以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的片段，将纯化后的PCR产物与回补载体pET22b同时用NdeⅠ，XhoⅠ双酶切，酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后，用T4DNA连接酶22℃过夜连接。

连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1。

提取疑似阳性克隆的质粒，用NdeⅠ，XhoⅠ双酶切和PCR分析鉴定，并经DNA序列分析验证。

将构建成的重组质粒转入大肠埃希菌JM109。

挑取重组质粒转化株单菌落接种于1ml等渗LB培养液中，37℃振荡培养过夜，以1∶100分别转接于20ml等渗LB培养液中，37℃振荡培养4h至对数生长期。

加入终浓度为mmol/L的IPTG，26℃振荡培养8h，离心收集菌体，加入裂解液并用超声破菌，取上清用镍柱按产品说明纯化UhpA蛋白。

　　凝胶阻滞试验

　　据NCBI公布的伤寒沙门菌Ty2基因组序列信息，设计特异性引物cysD，treB，设计引物位置为转录起始点上游约250bp，下游约50bp，总长度约300bp，以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出cysD基因以及treB基因启动子区域。

用酚仿乙醇法纯化PCR产物，取1～2μgPCR产物与不同浓度的UhpA蛋白混合，加入相应体积的GSM缓冲液，使三者反应总体积为20μl，30℃孵育15min。

选取198bp的真核生物PCR产物作为阴性对照，8%的丙烯酰胺胶电泳分离条带，溴化乙啶染色［8］。

　　2结果

　　uhpA回补株的构建

　　为进一步研究UhpA功能，本研究在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因，以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用特异引物扩增目的片段，全长841bp，包括uhpA的启动子，编码区域及终止子。

将纯化后的扩增产物与载体pBAD/gⅢ定向连接，构建成pBADuhpA重组质粒。

DNA序列分析显示重组区域无碱基突变，表明pBADuhpA重组质粒构建成功。

进而将pBADuhpA重组质粒和空质粒pBAD/gⅢ分别导入uhpA缺陷变异株，构建成uhpA回补株和对照株。

　　qRTPCR分析cysM和treB基因的表达

　　本研究选取半胱氨酸合成酶编码基因cysM和6磷酸海藻糖水解酶编码基因treB作为代表，用qRTPCR观察分析UhpA对硫代谢与海藻糖代谢相关基因表达的调节作用。

标准曲线以cysM为例。

结果显示高渗应激30min后，伤寒沙门菌uhpA缺陷株的cysM和treB的表达明显低于野生株，在回补株中两者的表达水平有明显恢复，而对照株中则无此现象。

　　UhpA蛋白表达

　　为了进一步研究UhpA对硫代谢及海藻糖相关基因是直接调控还是间接调控，本文设计凝胶阻滞试验，以分析UhpA能否与cysM和treB的启动子区域DNA片段结合，因此首先需通过原核表达获取UhpA蛋白。

将构建成功的重组表达质粒pET22buhpA转入大肠埃希菌JM109，加入终浓度为mmol/LIPTG，26℃诱导表达UhpA蛋白，经SDS－PAG电泳分析显示，表达的UhpA蛋白部分为可溶性，由于设计表达的蛋白C末端带有组氨酸标签，因此通过镍柱纯化获得了可溶性UhpA蛋白。

　　凝胶阻滞试验结果

　　为了观察UhpA能否与硫代谢及海藻糖相关基因的启动子区域DNA片段结合，本研究采用凝胶阻滞试验，将treB启动子区域的PCR产物和cysD启动子区域的PCR产物分别与不同浓度的UhpA蛋白以及作为对照用的适量的来自于真核生物DNA片段，在GSM缓冲液中30℃孵育15min后进行非变性PAG电泳，结果发现，UhpA蛋白与treB，cysD启动子区域无明显结合。

结果提示，UhpA对treB，cysD等基因的调控可能为间接作用。

　　3讨论

　　伤寒沙门菌是一种经消化道感染的重要人类致病菌，可造成全身系统性感染。

UhpB/UhpA双组分调节系统是沙门菌的一种十分重要的双组分调节系统，调控转运蛋白UhpT的表达，而有助于利用外