凉血活血法对肺纤维化小鼠羟脯氨酸和转化生长因子β1含量的影响Word文件下载.docx

凉血活血法对肺纤维化小鼠羟脯氨酸和转化生长因子β1含量的影响Word文件下载.docx

《凉血活血法对肺纤维化小鼠羟脯氨酸和转化生长因子β1含量的影响Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凉血活血法对肺纤维化小鼠羟脯氨酸和转化生长因子β1含量的影响Word文件下载.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

结果肺组织病理形态学观察发现模型组小鼠肺泡炎及纤维化程度明显高于阴性对照组；

与模型组比较,凉血活血法组肺组织中HYP含量显著降低（P＜0.01）,BALF中TGF-β1含量显著降低（P＜0.01）。

结论凉血活血法能明显减轻博莱霉素所致的小鼠肺纤维化程度,降低肺组织中HYP含量。

其机制可能是通过抑制TGF-β1蛋白表达,减少胶原蛋白的产生,使肺纤维化病变减轻。

【关键词】肺纤维化；

转化生长因子-β1；

羟脯氨酸；

凉血活血法；

小鼠

Abstract：

ObjectivesTostudytheeffectofcoolingbloodandinvigoratingcirculationmethodonpreventionandtreatmentofpulmonaryfibrosis,andexploreitsmechanism.MethodsMaleICRmicewererandomlydividedinto4groups：

negativecontrolgroup,pulmonaryfibrosismodelgroup,coolingbloodandinvigoratingcirculationgroupandprednisonepositivecontrolgroup.ThepulmonaryfibrosismodelofmicewereestablishedbyBLMnasalinstillation.After8hours,themiceweregivenprescriptionofcoolingbloodandinvigoratingcirculation（XijiaoDihuangdecoction）bygastricperfusion.Atthe28thdayaftertreatment,theindexesweredetected.TheTGF-β1contentofbronchoalveolarlavagefluid（BALF）wastestedbyenzymelinkedimmunosorbentassay,andhydroxyproline（HYP）wasexaminedbyalkalinehydrolysis.ResultsThedegreeofairsacculitisandfibrosisinmodelgroupareobviouslyhigherthanthenegativecontrolgroupbypathologicalobservation.Comparedwithmodelgroup,HYPcontentwasdecreasedobviouslyinherbgroup（P＜0.05）.Comparedwithmodelgroup,TGF-β1contentwasincreasedobviouslyinherbgroup（P＜0.05）.ConclusionsThemethodofcoolingbloodandinvigoratingcirculationcanreducethedegreeofairsacculitisandfibrosis,anddecreasethecontentofHYPandTGF-β1inlungtissueandBALF.ItspossiblemechanismmayberelatetoinhibitingTGF-β1expressionanddecreasingcollagenproteinproduction,whichleadtothereductionofdegreeofairsacculitisandfibrosis.

Keywords：

pulmonaryfibrosis；

TGF-β1；

hydroxyproline；

coolingbloodandinvigoratingcirculationmethod；

mice

2003年,传染性非典型肺炎肆虐,在其病理演变过程中可出现不同程度的纤维化病理改变[1]。

西医以皮质激素和细胞毒药物治疗,但仅有10%～30%肺纤维化患者经糖皮质激素治疗有一定的疗效[2],且激素不良反应大,常出现大面积股骨头坏死的情况,致残率非常高。

本实验研究凉血活血法对肺纤维化的干预作用,不仅为肺纤维化提供中医辨证论治新治法和有效方剂,而且从转化生长因子-β1（TGF-β1）含量变化探讨其作用机制。

　　1实验材料

　　1.1动物

雄性清洁级ICR小鼠28只,体重25～28g,中国医学科学院上海药物研究所实验动物中心提供,动物许可证号：

SCXK（沪）2004-0005号,饲养于清洁级动物房。

　　1.2药物

强的松片,上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产（批号071201）；

犀角地黄汤由水牛角、生地黄、赤芍、牡丹皮组成,饮片购于上海中医药大学附属曙光医院,按常规方法煎制成每毫升药液含1g原药材。

　　1.3试剂

天狼星红（SiriusRedF3B）,购自德国默克公司。

小鼠TGF-β1定量ELISA试剂盒,上海森雄科技实业有限公司生产；

羟脯氨酸（HYP）试剂盒,南京建成生物工程有限公司生产；

博莱霉素粉剂,每支15mg,日本化药株式会社生产（批号270560）。

　　1.4主要仪器

JJ300型精密电子天平,常熟双杰测试仪器厂制造；

K-70全自动高速冷冻离心机,湘仪-TOMY联合制造；

UV754N紫外-可见分光光度计,上海光学仪器厂制造；

Specotrat酶标比色仪,SLT公司制造。

　　2实验方法

　　2.1造模和分组

将雄性ICR小鼠随机分为阴性对照组、肺纤维化模型组、凉血活血法组、阳性对照组,每组7只。

适应性饲养1周后造模。

阴性对照组经鼻滴入生理盐水20μL,其余各组经鼻滴入博莱霉素7μg/g（20μL）建立肺纤维化模型。

各组小鼠于28d处死。

　　2.2给药

凉血活血法组用犀角地黄汤,阳性对照药用强的松片。

造模8h开始常规灌胃给药,每日1次。

各组给药剂量按人与小鼠体表面积比进行换算。

凉血活血法组小鼠的等效剂量为每日15.86g/kg；

阳性对照组给药剂量根据临床使用情况及文献用量定为1.3mg/kg,药液浓度为0.1mg/mL,用生理盐水作为溶剂；

模型组和阴性对照组给予等体积的生理盐水灌胃。

　　2.3肺间质纤维化小鼠肺组织病理学观察

新鲜分离的小鼠右下叶肺组织,常规经10%福尔马林固定和石蜡包埋。

每个蜡块连续切片2张,1张做常规HE染色,光镜下观察组织病理学变化；

1张用0.1%苦味酸天狼星红溶液做天狼星红染色,光镜下观察肺间质纤维化的有无及程度。

　　2.4肺间质纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量测定

取于-70℃冰柜冻存的肺组织,按南京建成生物工程研究所HYP测试盒说明书操作。

HYP含量结果以μg/g表示。

　　2.5肺间质纤维化小鼠支气管肺泡灌洗液转化生长因子-β1测定

各组小鼠处死后获取支气管肺泡灌洗液（BALF）,用ELISA法检测TGF-β1的蛋白含量,操作均按照试剂盒说明书进行。

　　3统计学方法

数据用SPSS15.0统计软件进行分析。

结果以x±

s表示,对各组数据行方差分析和组间比较（方差齐用LSD检验,不齐用Games-Howell检验）,P＜O.05为差异有统计学意义。

　　4结果

　　4.1凉血活血法对肺间质纤维化小鼠肺组织病理的影响

阴性对照组小鼠肺组织结构清晰,肺被膜未见纤维素渗出及炎细胞浸润,肺泡壁完整,肺泡隔完整、无增宽,无肺萎陷及血管壁增厚,支气管腔及肺泡腔内未见炎性渗出物,少数小鼠各级支气管壁及肺泡间隔可见少量炎细胞浸润。

模型组造模第28日时肺组织可见实变,实变区呈斑片状分布,在支气管周围病变尤为明显。

肺泡间隔增宽充血,可见大量炎细胞浸润。

局部Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,肺泡腔内可见巨噬细胞簇集成团,局部可见陈旧性出血灶,纤维母细胞及纤维细胞增生,纤维化区可见大量增生的纤维细胞和胶原纤维沉积,炎性细胞相对较少,可见大小不等的囊性纤维气腔形成即“蜂窝肺”。

造模第28日已具备成纤维细胞灶、伴胶原沉积的瘢痕化、蜂窝等诊断普通型间质性肺炎/特发性肺间质纤维化（UIP/IPF）的病变。

凉血活血法组和阳性对照组在用药28d后,病变程度与模型组相比有所减轻,而且凉血活血法组胶原沉积、成纤维细胞灶比阳性对照组减少,炎性浸润也减轻。

见图1、图2。

　　4.2凉血活血法对肺间质纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸、肺泡灌洗液转化生长因子-β1含量的影响

　　（见表1）表1各组小鼠肺组织HYP、BALF中TGF-β1含量比较（略）注：

与阴性对照组比较,#P＜0.01；

与模型组比较,△P＜0.01

　　5讨论

　　肺间质纤维化的特点是细胞外基质过度沉积,胶原蛋白合成的速度大于降解的速度,因此胶原纤维显著增多,最终导致胶原的逐渐累积。

HYP是胶原纤维中特有的一种氨基酸,约占胶原蛋白的13.4%,其他除弹性硬蛋白含少量HYP（约1%）外,均不含HYP。

因此,HYP含量的测定成为间接反映胶原含量的敏感指标而被广泛应用于肺间质纤维化的研究[3-4]。

本实验用凉血活血法防治肺纤维化28d后,HYP含量减少,说明凉血活血法能明显减轻博莱霉素所致的小鼠肺泡炎及纤维化程度。

　　TGF-β1参与纤维增殖性病变,是间叶细胞分化的重要调节因素,是强效的致纤维化因子[5]。

肺内的TGF-β1可由肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞、成纤维细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞、嗜酸性细胞等产生。

在损伤的早期,TGF-β1来源于血小板的α颗粒,将信号传导到间质间叶细胞,使其分化成肌成纤维细胞。

后期由于肺泡腔内充满了肌成纤维细胞,从巨噬细胞和间叶细胞来源的TGF-β1使运动增殖性细胞向胶原合成转化,这一过程将导致肺泡腔内胶原沉积、气腔收缩和肺泡塌陷。

TGF-β1对间叶细胞的增殖作用具有双向性。

在肺泡纤维化的增殖期,TGF-β1可通过诱导自分泌血小板转化生长因子（PDGF）而促进纤维增生；

随着气腔充满,TGF-β1可以直接通过下调细胞周期蛋白依赖激酶2和4导致细胞周期停止。

TGF-β1能够诱导产生PDGFα受体,从而使PDGF的作用放大[6]。

TGF-β1刺激细胞外基质（ECM）产生细胞,合成大量ECM；

抑制ECM降解酶主要为基质金属蛋白酶（MMPs）的活性；

增强这些降解酶抑制物的活性,从而减少ECM的降解；

刺激成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）基因表达,改变成纤维细胞收缩表型,调节肺炎细胞和上皮细胞的功能转变,发生表型转变的成纤维细胞能合成和分泌大量胶原等ECM成分,而且TGF-β1能增强ECM受体的表达,促进ECM与细胞粘附。

可见,TGF-β1在肺间