使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术Word文档格式.docx
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qPCRMix的形式提供，已混合了TaqDNA聚合酶、酶抗体、dNTP、PCRBuffer、SYBRGreenI、稳定剂和增强剂等试剂，只需加入模板、引物即可进行定量PCR反应。
SYBRGreen染料与双链DNA结合，在激发光的作用下发出荧光，通过荧光强度的测定，即可确定双链DNA的含量。
整个过程非常简单，最大限度的减少加样次数，有效避免加样误差及交叉污染。
特异性的酶抗体低温下可封闭Taq酶活性，从而获得HotStart功能，极大地提高了PCR反应的特异性。
不用繁琐的条件摸索，同样可以获得精确度好、重复性高的定量PCR反应。
『保存条件』-20℃避光保存，
『有效期』>
12个月。
『适用范围』
单个基因的PCR扩增及其荧光定量检测。
『使用方法』
使用时只需取适量2qPCRSmartMix溶液，加入引物和模板，并加入去离子水补足体积，使qPCRSmartMix溶液的浓度为1即可进行反应。
反应中实时采集荧光信号，PCR反应完成后，进行融解曲线分析。
『反应举例』
注意：
以下举例多数情况下可参考。
实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情况，设定最加反应条件。
用2PCRTaqMix产品，以人基因组DNA为模板，扩增0.5kb的片段，反应体系为25l。
如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量。
1.
将2×
qPCRSmartMix、模板DNA、引物以及去离子水在室温融化后混匀。
2.
准备PCR反应混合物。
冰浴中按下面的量加入各种反应物，混匀：
2qPCRSmartMix12.5l
Primer1（5M）1.25l
Primer2（5M）1.25l
Template0.5g
ddH2O补至25l
3.
按照下表所示，设置PCR扩增程序。
首次扩增某一模板时，一般先在延伸步骤采集数据，PCR反应完成后，进行融解曲线分析（见步骤5）。
以后扩增相同的模板时，可以根据融解曲线分析结果加入数据采集步骤（详见步骤6），以便获得更准确的定量结果。
步骤
时间
温度
说明
PCR起始激活步骤
10min
95°
C
激活TaqDNA聚合酶
3步或4步循环
变性
15sec
94°
退火
30sec
50-60°
比引物的Tm值大约低5-8°
C。
延伸
72°
如果未加入附加的数据获取步骤，则在这一步获取荧光数据。
可选：
数据获取
D°
引物Tm<
D<
产物Tm
循环数
35~40个循环
循环数与模板DNA的量相关
5.
进行PCR产物融解曲线的分析。
强烈推荐进行融解曲线分析，以验证PCR产物的特异性。
融解曲线分析是定量PCR仪配套软件中的分析步骤。
请根据仪器供应商的介绍进行操作。
一般而言，应当在65°
C~95°
C之间获取融解曲线数据。
引物二聚体的形成与引物设计及模板的拷贝数有关。
由于引物二聚体的融解温度较低，所以很容易与特异的产物区分开来。
6.
可选：
加入数据获取步骤后重复以前的循环。
为了消除由引物二聚体造成的荧光读数，可以在循环操作中加入数据获取步骤（见步骤3）。
温度设置应当高于引物二聚体的Tm值，但比特异性产物的Tm值大约低3°
在引物二聚体被同时扩增的情况下，这一方法可以提高检测的动态范围并提高定量的可信度。
7.
利用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物的特异性。
注意事项』
为了节约试剂，建议先用普通PCR优化好各种反应条件。
为了保证反应效率，使用SYBRGreenI进行荧光定量PCR时，扩增片段长度最好在50~500bp。
SYBRGreenI可以造成眼睛、皮肤及呼吸道的损伤，使用时请注意防护，最好佩带防护眼镜及手套。
4.
为了确保实验结果的可靠性，每次实验均应设置阴阳性对照。
本产品仅供科研使用。
请勿用于医药、临床治疗、食品等用途。
使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术
采用通过监测产物积累进行的实时反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）可以用来验证基因表达的差异。
我们在此报道了一种基于SYBRGreenI染料进行的实时PCR定量方法并通过产物的融解曲线来确定在基因表达谱方法中确定的基因表达差异的重复性。
因为SYBRGreenI染料是一种非特异性的结合染料，所以反应使用了"
热启动"
PCR以及通过经验性数据来确定退火以及检测产物的温度。
相对的基因表达水平可以通过使用一系列的cDNA浓度做出标准曲线来进行定量。
使用这种方法，实时PCR可以确定DNA阵列71%（17／21）的准确性，和91%（1／31）的差异显示的准确性。
验证DNA阵列的基因表达差异与杂交信号的强弱有关。
实时RT－PCR结果表明DNA表达差异在2－4倍间的差异无法判断其正确错误与否。
而差异显示PCR的结果验证不依赖于信号的强度。
无论是何种基因表达谱技术（微阵列，DDPCR，基因表达系列分析技术还是差异杂交技术），如果已经知道目的基因的序列，那么实时RT－PCR方法就可以适用于验证这些差异表达，因为它具有定量功能而且需要的RNA量比传统方法要低1000倍。
DNA阵列（微阵列）和差异RT－PCR方法是两种可靠的确证基因表达和基因组广泛转录本差异的方法。
这些技术确定样本表达差异的重复性和敏感性的可靠性受到几个因素的影响。
微阵列的实验结果受到阵列产物、RNA提取、探针标记、杂交温度条件和图像分析（1－4）的影响。
DD－PCR结果受到电泳分辨率、弱和差异引物、条带确证和结合部分的影响。
因为这些可靠性上的限制，被确定为差异表达的基因要经过另一种方法的检测。
Northern杂交或者RNA酶保护分析都是有效的但是至少要5mg的RNA。
传统的逆转录聚合酶链式反应（RT－DDPCR）要求的RNA要少一些，但其终点分析缺乏定量上的精确性（6－8）。
实时RT－PCR技术方法是当前最新的确定基因表达的方法，在这篇报道中，我们详细描述了使用实时PCR技术和其与DNA阵列以及DD－PCR技术的相互结合，来验证基因表达的正确性。
方法描述:
基本策略
为了满足验证表达谱研究确定的大量基因，我们研究了实时定量PCR系统并使用SYBRGreenI染料。
此外，还用每个基因的一系列已知浓度的模板制作了绝对定量曲线，以相对比较不同的样本。
相对定量曲线只需要使用在表达谱研究中确定的一个高表达样本中获得的cDNA的一系列稀释度制作完成。
尽管仍然需要设计基因特异性的引物，但不需要设计内在的基因特异性的荧光探针。
此外，反应的特异性由产物的Tm值确定（Tm：
DNA双螺旋一半解链时的温度）。
反应的特异性由"
PCR得到提高，并在低于产物Tm值1－2℃时获得信息。
这样就可以避免由通常来说Tm值较低的引物二聚体引起的非特异性信号（10）。
实时PCR的反应条件
逆转录反应条件
使用在基因表达谱分析中采用的总RNA进行验证实验。
采用SuperScriptFirstStrandSynthesisSystem进行RT-PCR（Invitrogen,Carlsbad,CA））反应来合成cDNA，反应体系为20ul，里面包含1mgDNaseI处理过的总RNA，20mMTris–HCl（pH8.4），50mMKCl，2.5mMMgCl2，10mMdithiothreitol（DTT），0.5mgoligo（dT）12–18,dNTP（各0.5mMdATP,dGTP,dCTP,和dTTP）以及200USuperScriptIIReverseTranscriptase。
混合组分时，先混合RNA和oligo（dT），70℃保温10分钟，再放到冰上并加入剩余的反应组分。
反应在42℃孵育1小时，然后再70℃加热15分钟终止反应。
cDNA再加入2U的RNaseH（Invitrogen）37℃孵育20分钟，再在70℃加热15分钟终止反应。
此外用一个没有逆转录酶的反应来验证是否有基因组DNA的污染（无RT对照）。
cDNA在使用前放置在－20℃保存。
进行实时定量PCR前不需要进行cDNA的纯化。
确定实时定量PCR的反应条件
使用GENSETOLIGOS,OligoVersion4,（GENSETCorp.,LaJolla,CA）或者LASERGENE的PRIMERSELECT软件（DNASTAR,Inc.,Madison,WI）计算产物的Tm值来确定反应的退火温度。
摸索退火温度时，每次以计算得到的Tm值增加或减少2－3℃，直到其与引物二聚体和非特异性产物间有3－5℃的差别。
信息采集时候的温度可以设置到特异性产物的Tm值以下1－2℃，以减少非特异性产物的干扰。
反应步骤和循环条件
所有的步骤按照仪器的使用说明进行。
按照试剂说明将包含有TagDNA聚合酶，dNTP,MgCl2,和SYBRGreenI染料的DNAMasterSYBRGreenI混合液与0.16mlTaqStartAntibody（Clontech,PaloAlto,CA）混合一起室温孵育5分钟，然后再加入引物和cDNA模板。
除此外，每个反应（20ul）中包含2ul的cDNA，0.4mM的引物和4mMMgCl2。
使用1:
200和
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